山楂胚離體培養(yǎng)及四倍體誘導(dǎo)研究

摘 要： 以山楂為材料，研究了幼胚和成熟胚離體培養(yǎng)及四倍體誘導(dǎo)技術(shù)。花后40 d的山楂幼胚離體培養(yǎng)的成苗率很低，供試的15份資源的成苗率都小于20%。成熟胚離體培養(yǎng)的成苗率較高，調(diào)查的4份資源的成苗率均大于50%。用0.5%秋水仙堿+1%二甲基亞砜的混合溶液處理山楂成熟胚48 h，然后在SC+IBA 0.1 mg·L-1+ TDZ 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽分化。對秋水仙堿處理成熟胚再生植株進(jìn)行莖尖染色體數(shù)目觀察，檢測的67個隆化粉肉植株中有3個是四倍體，變異率達(dá)4.5%。研究建立了山楂多倍體離體誘導(dǎo)體系，為培育山楂多倍體品種奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 山楂； 胚； 離體培養(yǎng)； 四倍體

中圖分類號：Ｓ６６1．5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0071－０4

In vitro embryo culture and tetraploid induction of Hawthorn

DAI Hong-yan1，GUO Xiu-wu1，HE Ping2，ZHANG Zhi-hong1

（1College of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110866 China； 2Shandong Institute of Pomology，Tai’an，Shandong 271000 China）

Abstract: In vitro culture of immature and mature embryos and tetraploid induction of hawthorn were investigated. The rate forming seedlings from in vitro immature embryo of hawthorn harvested 40 days after blooming was very low and it was less than 20% for 15 tested accessions. But the rate forming seedlings from in vitro mature embryo was high， and it was more than 50% for 4 accessions. The mature embryos of hawthorn was dipped in the mixed solution of 0.5% colchicine and 1% dimethyl sulfoxide for 48 h and transferred to SC solid medium supplemented with 0.1 mg·L-1 IBA and 1.0 mg·L-1 TDZ to induce bud differentiation. Cytological analysis showed that 3 out of 67 regenerated plants of Longhuafenrou were tetraploid and the variation rate reached 4.5%. The system of in vitro induction of tetraploid for hawthorn was developed， and this laid a sound foundation for breeding of polyploid cultivars in hawthorn.

Key words: Hawthorn； Embryo； In vitro culture； Tetraploid

山楂（Crataegus spp.）廣泛分布于亞洲、歐洲、中北美洲及南美洲的北部，是薔薇科（Rosaceae）中一種重要的植物。雖然早在15世紀(jì)山楂作為果樹就在中國進(jìn)行栽培，但是目前生產(chǎn)上沒有利用雜交或現(xiàn)代技術(shù)手段培育的山楂品種[1]。多倍體果樹一般具有生長健壯、枝粗、葉厚、果大、少子或無子、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點，因此，多倍體育種一直是果樹育種的一條重要途徑。山楂野生資源和大果山楂栽培品種中存在多倍體類型[2]，三倍體山楂品種具有樹勢強(qiáng)、果實大、豐產(chǎn)性好等優(yōu)點，因此，多倍體育種是山楂育種的一個重要方向。

離體誘導(dǎo)多倍體是目前獲得植物多倍體的主要方法，但至今尚無山楂多倍體誘導(dǎo)的研究報道。山楂葉片離體再生不定芽體系已經(jīng)建立[3]，但是再生效率較低，達(dá)不到離體誘變的要求。本研究分析品種、胚發(fā)育程度、培養(yǎng)基等對山楂胚離體培養(yǎng)的影響，建立山楂胚離體培養(yǎng)體系，并在此基礎(chǔ)上建立山楂四倍體植株離體誘導(dǎo)體系，獲得了新的山楂四倍體資源，為山楂多倍體育種奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

開放授粉的山楂果實采自國家果樹種質(zhì)沈陽山楂圃。幼胚是在花后40 d采集，成熟胚在果實完全成熟后采集。

供試的山楂試材包含山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）、大果山楂（C. pinnatifida Bge. var. major N.E.Br.）、伏山楂（C. brettschnederi）、遼寧山楂（C. sanguinea Pall.）和毛山楂（C. maximowiczii Schneid.）等4個種和1個變種。其中，大果山楂試材包括磨盤、蒙陰大金星、益都敞口、益都大黃面、隆化粉肉、甜水、秋金星、大金星等8個品種，伏山楂試材包括伏里紅、左伏1、左伏2、吉伏2等4個品種，山楂為開原軟籽，遼寧山楂和毛山楂各選野生資源1份，共計15份試材。幼胚離體培養(yǎng)試驗中，以全部15份試材的幼胚為外植體；成熟胚離體培養(yǎng)試驗中，以大果山楂品種磨盤、秋金星、霞金星和隆化粉肉的成熟胚為外植體，離體誘導(dǎo)四倍體試驗中，以隆化粉肉的成熟胚為外植體。

1.2 外植體接種和培養(yǎng)

1.2.1 幼胚接種和培養(yǎng) 采集花后40 d的山楂幼果，用單面刀片切去萼筒端果肉，可見白色的幼胚，再縱向切開果肉取幼胚，消毒后接種在培養(yǎng)基上。消毒的方法為：將幼胚放入100 mL三角瓶中，首先加入70%乙醇浸泡30 s，然后用0.1% HgCl2浸泡10 min，最后無菌水清洗3次。消毒后將幼胚接種在MS + BA 1.0 mg·L-1 + GA3 1.0 mg·L-1 + IBA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基上。培養(yǎng)30 d以后，轉(zhuǎn)移到MS + BA 1.0 mg·L-1+ GA3 2.0 mg·L-1+ IBA0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)30 d后，轉(zhuǎn)移到MS + BA 2.0 mg·L-1 + GA3 3.0 mg·L-1+ IBA0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上。

1.2.2 成熟胚接種和培養(yǎng) 將種子從山楂果實中取出，然后去除種子外殼（核皮），取出完整的種子。將種子放在100 mL三角瓶中，加入70%乙醇浸泡30 s，然后用0.1% HgCl2浸泡10 min，最后無菌水清洗3次。種子消毒后，在無菌條件下剝?nèi)シN皮，然后將完整的成熟胚接種在培養(yǎng)基上。設(shè)計3種培養(yǎng)基，分別是： （1）SC[4] +BA 1.0 mg·L-1+GA3 5.0 mg·L-1；（2）SC+TDZ1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；（3）SC+TDZ1.5 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1。

1.3 秋水仙堿處理

種子消毒后，在無菌條件下剝?nèi)シN皮，然后將完整的成熟胚放在經(jīng)抽濾滅菌的0.5%秋水仙堿+1%二甲基亞砜的混合溶液中黑暗處理48 h，溫度25 ℃。處理結(jié)束后，倒掉秋水仙堿溶液，用無菌水將胚沖洗3次，然后接種在SC + IBA 0.1 mg·L-1 + TDZ 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基上。

1.4 新梢分化

當(dāng)秋水仙堿處理后的山楂成熟胚培養(yǎng)30 d后，將再生有叢生芽的胚轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基（SC + BA 1.0 mg·L-1 + GA3 3.0 mg·L-1）中，以加速新梢的生長。

1.5 培養(yǎng)基制作

按照常規(guī)方法制備培養(yǎng)基。用0.7%瓊脂條固化培養(yǎng)基。用1 mol·L-1的NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到5.8。將培養(yǎng)基分裝到100 mL三角瓶中（每個三角瓶中約倒入35 mL培養(yǎng)基），然后在121 ℃滅菌20 min。

1.6 培養(yǎng)條件

離體培養(yǎng)試驗在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹細(xì)胞工程實驗室中進(jìn)行。培養(yǎng)室溫度：（23±2） ℃，光照周期16 h，光照強(qiáng)度約2 000 lx。。

1.7 染色體計數(shù)

當(dāng)山楂再生小植株的株高達(dá)到5 cm左右時，于上午9:00-10:30剪取頂端新梢，去掉葉片，剝?nèi)?.5～0.8 cm的莖尖，然后放入對二氯苯飽和水溶液中預(yù)處理5～6 h。預(yù)處理結(jié)束后，將材料轉(zhuǎn)入卡諾固定液（95%乙醇:冰醋酸=3:1）中固定2 h，然后在70%乙醇中保存。

將預(yù)處理過的莖尖浸在5 mol·L-1鹽酸中，常溫下解離3 min，然后用蒸餾水洗去殘留的鹽酸。將解離后的莖尖放在載玻片上，加上1滴改良堿性品紅進(jìn)行染色，隨后壓片鏡檢。

1.8 統(tǒng)計分析

胚培養(yǎng)的成苗率計算公式如下：成苗率（%）=成苗的胚數(shù)/接種胚數(shù)×100；對誘導(dǎo)處理獲得的植株進(jìn)行染色體計數(shù)后，統(tǒng)計變異率，計算方法如下：變異率（%）=變異植株數(shù)/調(diào)查植株數(shù)×100。變異植株指成熟胚經(jīng)處理后再生的染色體數(shù)目發(fā)生變化的植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂胚培養(yǎng)

2.1.1 山楂幼胚離體培養(yǎng) 大部分花后40 d的山楂幼胚在培養(yǎng)60 d后干癟死亡，部分幼胚子葉變綠并增大，但胚不發(fā)育。培養(yǎng)150 d后，供試的15份山楂種質(zhì)資源中只有益都大黃面、隆化粉肉、吉伏2、左伏1、毛山楂、伏里紅、甜水、大金星等8份試材的幼胚分化成苗，但是成苗率都小于20%（表1），而磨盤、蒙陰大金星、益都敞口、秋金星、開原軟籽、左伏2、遼寧山楂等7份試材的幼胚未分化成苗。

2.1.2 山楂成熟胚離體培養(yǎng) 山楂成熟胚大約在接種10 d后開始萌發(fā)，3周后子葉充分展開、胚芽梢長度可達(dá)到1 cm左右。有些胚不僅胚芽萌發(fā)，而且在子葉節(jié)部位分化出不定芽。在（1）號培養(yǎng)基上，山楂的胚芽梢生長迅速，而在（2）號和（3）號培養(yǎng)基上，胚芽梢生長緩慢，并在子葉節(jié)處發(fā)出較多的不定芽。（2）號培養(yǎng)基上山楂成熟胚分化的不定芽數(shù)是（3）號培養(yǎng)基的1.2倍。

不同山楂品種的飽滿種仁率和成熟胚離體培養(yǎng)的成苗率存在一定的差別。三倍體品種磨盤的飽滿種仁率只有2.6%，但是其飽滿的成熟胚離體培養(yǎng)的成苗率較高，達(dá)到73.3%；在二倍體品種中，隆化粉肉的飽滿種仁率最低，只有25.4%，其飽滿的成熟胚離體培養(yǎng)的成苗率（54.4%）也比其他二倍體品種低（表2）。

2.2 離體誘導(dǎo)山楂四倍體

經(jīng)秋水仙堿處理后的山楂成熟胚的生長發(fā)育受到明顯的抑制（圖版-A）。在（2）號培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，成熟胚分化出芽，多數(shù)芽是在胚芽和子葉節(jié)部位分化出來的（圖版- B），還有一些芽是在子葉上形成的（圖版-C）。經(jīng)秋水仙堿處理后的山楂成熟胚產(chǎn)生了一些明顯粗壯的芽（圖版-B），這些芽在繼代培養(yǎng)基上分化成粗壯的新梢（圖版-D）。染色體檢查結(jié)果表明，這些粗壯的新梢多為四倍體植株。

山楂的染色體組包含17條染色體，二倍體山楂品種的體細(xì)胞中有34條染色體，即：2n=2x=34（圖版-E）。對67個隆化粉肉的成熟胚再生植株進(jìn)行了染色體數(shù)目觀察，發(fā)現(xiàn)其中的3個植株是四倍體（2n =4x=68）（圖版-F），變異率達(dá)4.5%。

3 討 論

高效離體再生體系的建立是遺傳轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞克隆變異篩選和離體誘變育種的重要基礎(chǔ)。植物的離體再生器官能力受遺傳控制，人們把植物細(xì)胞、組織和器官不能響應(yīng)組培條件的現(xiàn)象稱作頑拗性（recalcitrance）[5]。多數(shù)木本植物在離體培養(yǎng)上屬于頑拗性物種[6]，表現(xiàn)為難以建立無菌培養(yǎng)物，離體再生不定器官易受培養(yǎng)條件和外植體發(fā)育程度和生理狀態(tài)的影響，再生效率低下[7-9]。山楂葉片離體再生不定芽頻率小于50%，子葉和上胚軸離體再生不定芽的最高頻率分別為33.3%和28.0%[3]，這說明山楂屬于組培頑拗性物種。雖然山楂葉片和子葉離體再生不定芽的頻率較低，但是與其他木本植物相比，山楂的平均每個外植體再生不定芽數(shù)并不低。在附加高濃度細(xì)胞分裂素和生長素類物質(zhì)的培養(yǎng)基上，許多山楂外植體分化出叢生芽，而且它們的分化經(jīng)歷了一個短暫的愈傷組織階段[3]，這對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和離體誘變育種是非常有利的[10]。本研究的離體誘導(dǎo)山楂四倍體的試驗結(jié)果也證實了這一點。

用于誘變多倍體的化學(xué)藥劑是一些抗微管物質(zhì)，主要有秋水仙堿、安磺靈（oryzalin）、戊炔草胺（pronamide）、氟樂靈（trifluralin）等[11]，其中最被廣泛應(yīng)用的是秋水仙堿。傳統(tǒng)的化學(xué)誘變多倍體方法采用活體處理的方式，其主要缺點是誘變率較低，嵌合體比率高，不利于多倍體的獲得和應(yīng)用。植物離體再生的體細(xì)胞胚通常是單細(xì)胞起源的，不定芽是單細(xì)胞或幾個細(xì)胞起源的，因此，在離體培養(yǎng)過程中進(jìn)行誘變處理，不僅可以大大降低嵌合體發(fā)生的頻率，而且誘變率也較高。隨著離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，離體誘變四倍體在許多園藝植物上獲得成功，如蘋果[12]、梨[13]、葡萄[14]、石榴[15]等。

在果樹四倍體誘導(dǎo)研究中，多數(shù)以無性繁殖材料為試材，也有以有性繁殖的胚為試材。如果能夠從四倍體材料中選育出栽培品種，那么對無性繁殖的材料進(jìn)行加倍比對有性繁殖的材料進(jìn)行加倍更具有優(yōu)勢。但是一些果樹的四倍體表現(xiàn)不如三倍體，如四倍體蘋果結(jié)實率低、果形指數(shù)小且常常不規(guī)則，因此，難以從四倍體蘋果中選育出優(yōu)良的栽培品種[16-17]。所以，誘導(dǎo)獲得的四倍體多被用作培育三倍體的雜交親本。如果四倍體的主要用途是作為雜交親本培育三倍體，那么無性繁殖材料誘導(dǎo)獲得的四倍體與有性繁殖材料誘導(dǎo)獲得的四倍體在利用價值上沒有質(zhì)的區(qū)別，因為經(jīng)過減數(shù)分裂，優(yōu)良品種的優(yōu)勢效應(yīng)解體。（本文圖版見插3）

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