喹諾酮鍵聯(lián)卟啉合成及與牛血清白蛋白的相互作用

摘 要：基于卟啉化合物的光敏性和對腫瘤細(xì)胞有特殊的親和力以及喹諾酮類化合物的抗癌活性，設(shè)計合成了10個喹諾酮鍵聯(lián)卟啉化合物，其結(jié)構(gòu)由1H NMR， IR， UV-Vis和MS表征.同時，利用熒光光譜考察了上述喹諾酮鍵聯(lián)卟啉與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，結(jié)果表明它們對BSA熒光有較強(qiáng)的靜態(tài)猝滅作用.

關(guān)鍵詞：卟啉；喹諾酮；牛血清白蛋白；合成；熒光光譜

中圖分類號：O621.33；O657 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Synthesis of Quinolone-bonded Porphyrins and Their Interaction with Bovine Serum Albumin

JIANG Guo-fang， LIU Yong-bo， WU Qian， ZENG Chun-jiao， WANG Kai-ji， GUO Can-cheng

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Hunan Univ，Changsha，Hunan 410082， China )

Abstract:Ten quinolone-bonded porphyrins were designed and synthesized on the basis of both porphyrin’s photosensitivity and special affinity for tumor cells and quinolones’ antitumor and anticancer activities. The molecular structures of all synthesized compounds were characterized with 1H NMR， IR， UV-Vis and MS. The interaction between quinolone-bonded porphyrins and bovine serum albumin (BSA) was investigated with fluorescence spectrum. The results have shown that these new quinolone-bonded porphyrins have a powerful ability of quenching the fluorescence of BSA via static quenching.

Key words:porphyrin; quinolone; bovine serum albumin; synthesis;fluorescence spectrum

喹諾酮類抗菌劑在細(xì)胞內(nèi)的主要靶酶是細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶II (Topo II)[1]， Topo II是許多重要的抗腫瘤藥物細(xì)胞內(nèi)的主要靶酶，如依托泊昔等.抗腫瘤藥物殺死癌細(xì)胞的機(jī)理和喹諾酮?dú)⑺兰?xì)菌的機(jī)理相似，2種藥物都能和Topo II相互作用并影響DNA的形成.通過比較序列已知的細(xì)菌和哺乳動物拓?fù)洚悩?gòu)酶II，發(fā)現(xiàn)不僅n型拓?fù)洚悩?gòu)酶在活性部位酪氨酸周圍的序列有同源性，而且I型酶和II型酶也具有同源性.因此，喹諾酮有希望成為新一類抗腫瘤候選化合物.卟啉類化合物對惡性腫瘤有特殊的親和力[2]，對腫瘤細(xì)胞有定位作用， 同時對DNA有一定的識別和斷裂功能及在光照下能活化分子氧[3]等特點(diǎn)，使其在光動力學(xué)治療腫瘤和分子識別等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[4-6]，為癌癥的診斷和治療開辟了新途徑.因此，將喹諾酮類衍生物與卟啉相連有望增大藥物對腫瘤組織的定位作用而降低毒副作用，在同劑量條件下，可提高療效.本文報道了以氟哌酸為原料合成7種喹諾酮衍生物，再通過酰胺鍵或氨基酰胺鍵與卟啉鍵聯(lián)，合成了10個喹諾酮衍生物鍵聯(lián)卟啉，并利用熒光光譜探討了它們與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

OptiMelt型顯微熔點(diǎn)儀(斯坦福研究系統(tǒng))；INOVA-400MHz核磁共振儀(美國Varian公司)；ZAB-HS質(zhì)譜儀(英國VG公司)；FD-5DX紅外光譜儀(KBr壓片)(美國Nicolet公司)；UV-2450紫外光譜儀(日本島津公司)；日立F-4500熒光光譜議(日立公司).

牛血清白蛋白(BSA)購于上海生物試劑公司；諾氟沙星購于河南康泰制藥集團(tuán)公司；硅膠GF254(青島海洋化工廠產(chǎn)品)；其他試劑為市售化學(xué)純或分析純試劑，要求無水的溶劑均經(jīng)去水處理和重蒸.

1.2 實驗過程

化合物2，3參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]及經(jīng)過改進(jìn)而合成，合成路線如圖1所示.

圖1 喹諾酮衍生物的合成

Fig.1 Synthetic routes of quinolone derivatives

5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉按文獻(xiàn)方法進(jìn)行合成[11].5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉與二氯亞砜反應(yīng)，之后分別與化合物2a～2d，以及3a～3c反應(yīng)，得到喹諾酮衍生物鍵聯(lián)卟啉化合物4a～4g.合成路線如圖2所示.

5-(4-羧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉按文獻(xiàn)方法進(jìn)行合成[12].5-(4-羧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉與光氣反應(yīng)，之后分別與化合物2a，2b，3c反應(yīng)，得到喹諾酮衍生物鍵聯(lián)卟啉化合物5a～5c.合成路線如圖3所示.

1.3 化合物的合成

1.3.1 喹諾酮衍生物2a～2d以及3a～3c的合成

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，設(shè)計合成了7種喹諾酮衍生物2a～2d以及3a～3c，如圖1所示.其結(jié)構(gòu)均由1H NMR， IR， UV-Vis和MS表征正確.

1.3.2 單氨基卟啉與喹諾酮衍生物的鍵聯(lián)反應(yīng)[10]

如圖2所示，單氨基卟啉(5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉)按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行合成[11].

13 mg(4.16×10-5 mol)三光氣用10 mL無水1，2-二氯乙烷溶解后，緩慢滴加到溶于20 mL無水1，2-二氯乙烷的70 mg單氨基卟啉(1.11×10-4 mol)和三乙胺(31 μL，4.68×10-4 mol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，回流攪拌3 h，最后滴加入1.22×10-4 mol的2或者3的1，2-二氯乙烷(5 mL)，在50 ℃反應(yīng)， 2.5 h后結(jié)束反應(yīng)，減壓旋除溶劑后，以三氯甲烷、甲醇和少量三乙胺作為淋洗劑，進(jìn)行梯度洗脫，收集第三帶.

5，10，15-三苯基-20-{4-[ 1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-喹諾酮-3-羧酸甲酯-7-(4-哌嗪基-1-甲酰胺基)]苯基}卟啉(4a)， 產(chǎn)率80%， UV-vis [λmax， nm (ε×10-3cm-1#8226;mol-1#8226;L)] in CH2Cl2: 289， 419， 516， 551.5， 590， 646; 1HNMR (400 MHz， CDCl3)， δ: -2.78 (s， 2H)， 1.55 (t， 3H， J=7.2 Hz， N-CH2-CH3)， 3.36 (s， 4H， piperizine CH2)， 3.86 (s， 4H， piperizine CH2)， 3.94 (s， 3H， C(O)O-CH3)， 4.20 (q， 2H， J=7.2 Hz， N-CH2)， 6.80 (d， 1H， JH-F=6.5 Hz，8-H)， 6.95 (bs， 1H， N-H)， 7.75~7.78 (m， 11H， Ph-H)， 8.13~8.22 (m， 9H， Ph-H， 5-H)， 8.47 (s， 1H， 2-H)， 8.84 (s， 6H， pyrrolic-H)， 8.89 (d，2H， pyrrolic-H); IR (KBr) ν: 3450 (N-H)， 3311 (N-H)， 2 924， 2 846 (CH2)， 1 722， 1 670 (C=O)， 1 485 (C=C)， 1 351 (C-N)， 1 245 (C-F)， 798 cm-1; MS(APCI-MS)m/z: 990.1(M+2H).

化合物4b～4g其結(jié)構(gòu)均由1H NMR， IR， UV-Vis和MS表征正確.

1.3.3 單羧基卟啉與喹諾酮衍生物的鍵聯(lián)反應(yīng)

如圖3所示，單羧基卟啉(5-(4-羧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行合成[12].

將40 mg(0.06 mmol)單羧基卟啉溶于15 mL干燥的三氯甲烷中，用移液管移取新蒸的氯化亞砜(4 mL，54.6 mmol)加熱回流3 h，冷卻，減壓蒸除溶劑和過量的氯化亞砜，a得到的5，10，15-三苯基-20-(4-氯甲酰基)苯基卟啉溶于15 mL三氯甲烷中，在0~5 ℃滴加到0.05 mmol的2a 或2b 或3c和0.2 mL(1.4 mmol)的三乙胺的10 mL的三氯甲烷中，隨后在室溫下反應(yīng)5.5 h.反應(yīng)完畢后，加入10 mL水和15 mL氯仿，分出有機(jī)層，再用20 mL氯仿萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干后，濕法上樣，柱層析分離，先后以三氯甲烷∶丙酮=5∶1，三氯甲烷∶丙酮=3∶1為洗脫劑，收集第三帶.

5，10，15-三苯基-20-{4-[ 1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-喹諾酮-3-羧酸-7-(4-哌嗪基-1-甲酰基)]苯基}卟啉(5a)， 產(chǎn)率47%， UV-vis [λmax， nm (ε×10-3 cm-1#8226;mol-1#8226; L)] in CH2Cl2: 280， 419， 516， 550， 590， 646.5; 1HNMR (400 MHz， CDCl3)， δ:-2.79 (s， 2H)， 1.43 (t， 3H， J=7.2 Hz， N-CH2-CH3)， 2.32 (s， 3H， Ph-CH3)， 3.41 (s， 4H， piperizine CH2)， 4.05~4.25 (m， 6H， piperizine CH2，N-CH2)， 6.80 (d， 1H， 8-H)， 7.5(d， 1H， 5-H)， 7.72~7.89 (m， 11H， Ph-H)， 8.20~8.29 (m， 9H， Ph-H， 2-H)， 8.83~8.91 (m， 8H， pyrrolic-H); IR (KBr) ν: 3 442 (N-H)， 3 361， 3 317 (N-H)， 2 922， 2 850 (CH2)， 1 664 (C=O)， 1 495 (C=C)， 1 352 (C-N)， 1 239 (C-F)， 802 cm-1; MS(ESI)m/z: 960.0(M+H)， 961.0(M+2H).

化合物5b～5c其結(jié)構(gòu)均由1H NMR， IR， UV-Vis和MS表征正確.

1.4 牛血清白蛋白實驗

分別移取1 mL 2.0×10-5 mol/L的牛血清白蛋白(BSA)溶液和2 mL PBS緩沖溶液于10 mL的容量瓶中，用不同體積的喹諾酮衍生物卟啉進(jìn)行滴定，二次蒸餾水定容，溫育10 min，恒溫(25 ℃)下測定熒光光譜，激發(fā)波長λex = 280 nm，記錄300～400 nm范圍內(nèi)BSA在喹諾酮衍生物卟啉作用下的熒光猝滅光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成方法(條件)討論

單氨基卟啉與喹諾酮衍生物的反應(yīng)中，使用三光氣代替光氣并成功地將氨基轉(zhuǎn)變?yōu)楫惽杷狨ィ皇褂?，2-二氯乙烷作為溶劑明顯比使用二氯甲烷的收率高，且副產(chǎn)物更少，分離更容易；第二步反應(yīng)溫度應(yīng)為50～70 ℃，反應(yīng)時間應(yīng)為2.5～3 h，若超過10 h，則反應(yīng)副產(chǎn)物增加且難以分離.該反應(yīng)中的收率普遍較高(在70%左右)，由此可見，利用氨基卟啉與藥物實現(xiàn)鍵聯(lián)是一種非常可行的新方法.需要特別注意的是，第一步反應(yīng)需要在無水無氧的環(huán)境中進(jìn)行.

單羧基卟啉與喹諾酮衍生物的反應(yīng)中，使用三氯甲烷作為反應(yīng)溶劑，考慮到3a在三氯甲烷中的溶解性較差的問題，我們使用超聲波使反應(yīng)物均勻分散在三氯甲烷溶液中，因而反應(yīng)更加充分，實驗表明，3a收率由29%提高到了49%.在5b 分離時，用單一的三氯甲烷和丙酮體系作淋洗劑進(jìn)行分離非常困難，經(jīng)過反復(fù)實驗最終找到了一種很好的分離方法：先以乙酸乙酯為洗脫劑，洗下第一、第二色帶，再以三氯甲烷︰丙酮=3︰1為洗脫劑收集第三帶，成功地分離提純了目標(biāo)產(chǎn)物.

2.2 牛血清白蛋白實驗

本文對化合物4中的7種卟啉化合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用進(jìn)行了初步研究，如圖4所示，實驗表明所合成的卟啉化合物4f滴定BSA溶液時，牛血清白蛋白的熒光發(fā)射波長明顯藍(lán)移，這在一定程度上說明兩者有較強(qiáng)的作用力，另外，在相同的卟啉濃度下，化合物4中4e～4g的3種卟啉化合物的藍(lán)移較大(均藍(lán)移了16 nm左右)，4a～4d的4種卟啉化合物的藍(lán)移較小(均藍(lán)移了8 nm左右).這初步說明了喹諾酮衍生物卟啉結(jié)構(gòu)的改變對牛血清白蛋白的熒光發(fā)射波長有一定的影響.由圖4可以看出，隨著喹諾酮衍生物鍵聯(lián)卟啉濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸被猝滅，說明喹諾酮衍生物鍵聯(lián)卟啉對BSA都有很好的熒光猝滅作用，表明兩者之間存在相互作用，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移.

波長/nm

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