內生真菌原生質體制備與再生條件研究

摘要 本文通過對一株產紫杉醇菌株的原生質體的制備與再生影響因素的研究，結果顯示，菌株原生質體制備、再生的最佳條件是2%纖維素酶+3%蝸牛酶組成的復合酶系，30℃，以0.7mol/L NaCl為滲透壓穩定劑，酶解時間為6h ，原生質體的得率為5.30€？07個/ml。在28℃，0.7mol/L NaCl為滲透壓穩定劑的再生培養基中避光再生培養2d ，原生質體的再生率約為25.63 %。

關鍵詞 內生真菌 原生質體 制備 再生。

引言

紫杉醇（taxol）是一種復雜的具有抗癌活性的二萜生物堿，在臨床上用于治療多種惡性腫瘤。紫杉醇產生菌是周東坡等從東北紅豆杉韌皮部分離到的一種內生真菌，紫杉醇產量經HPLC測定為51.06 -125.70 g/L ，較1993年以前報道的其它菌種發酵單位高。

在工業微生物領域，將藥用菌原生質體誘變技術應用于遺傳育種，不僅可以縮短育種時間，降低工作量，而且還可達到改良菌種性狀、創造出新的優良性狀的效果。本文通過研究影響紫杉醇產生菌原生質體的分離與再生的酶系統及菌齡，從而篩選出適合的原生質體分離與再生的條件，為其誘變育種奠定基礎。

一、材料與方法

（一）材料

1、供試菌種 產紫杉醇TAXOL-8菌株，由陜西國際商貿學院微生物與免疫實驗室提供。

2、培養基 PDA液體培養基；PDA固體培養基；再生培養基。

3、 酶解液 2.00﹪纖維素酶；2.00%蝸牛酶；不同比例的纖維素酶和蝸牛酶組合酶系。

4、試劑 滲透壓穩定劑： 0.7mol/L NaCl，pH6.0； 工具酶：蝸牛酶、纖維素酶。

5、儀器與設備 恒溫振蕩器；高速低容量冷凍離心機；光學顯微鏡。

（二）方法

1、菌種活化 配制母種培養基，分裝試管，于121.3℃滅菌30 min后放置斜面， 28℃培養后，4℃冰箱備用。

2、液體培養 制備液體培養基分裝，30 mL/100 mL，于121.3℃滅菌30 min，種接，28℃恒溫培養24h后，1000 r/ min 振蕩培養。

3、收集菌絲體 抽濾發酵液得菌絲體，以無菌水和滲透壓穩定劑各洗滌3次（5min/次）。

4、原生質體制備 將菌絲體置于1mL的離心管中，按1：3（菌絲體濕重g：酶液體積mL）的比例，30℃，pH6.0的條件下進行酶解。酶解過程中每隔1h振蕩1次，使酶解液均勻，反應期間每隔1h吸取少量酶解液鏡檢，觀察原生質體產生情況。4500 r/ min離心10 min后棄去上清液，用穩滲劑洗2次后重新懸浮于0.7mol/L NaCl的穩滲劑中，鏡檢，計數。

原生質體制備率（Fp）=原生質體個數（Np）/酶解液體積（V）

5、原生質體再生 取原生質體懸液200 L置于再生培養基，將原生質體用無菌水低滲處理作對照，于28℃下培養2d，鏡檢計數，求再生率。

再生率=（再生菌落數- 對照處理再生菌落數）/鏡檢原生質體數/mL€？.2€？00%.

二、結果與分析

（一）紫杉醇產生菌原生質體的制備

1、不同種類酶液對原生質體制備率的影響 按1︰3（菌絲體濕重g：酶液體積mL）的比例將菌絲體（培養9d）加入到不同種類酶液中，30℃，pH6.0的條件下酶解6h。不同種類酶液對原生質體產率的影響見表1。