限制酶的多種切割方法及其在高考題中的體現

仔細研究近年來各地的生物高考題，發現限制酶的切割方法是高考中的熱門考點。下面就對限制酶主要的切割方法進行分析總結，歸納其優缺點。

一、錯位切割含目的基因的DNA片段和運載體──形成黏性末端

1. 單酶切

（1） 同一種限制酶分別切割含目的基因DNA片段與運載體。這是最簡單的一種方法，含目的基因的DNA片段與運載體在同種限制酶作用下形成相同的黏性末端，這兩個黏性末端間能通過堿基間的配對而連接，進而形成重組DNA分子。

（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段與運載體。有一些來源不同的限制酶識別核苷酸順序和切割位置都相同，這類酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。同裂酶產生同樣的切割，形成相同的黏性末端。

2009年江蘇生物高考第34題就出現了同裂酶（BamHⅠ與 BstⅠ），其中的差別只在于當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。

（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段與運載體。有一些來源不同、識別的核苷酸順序和切割位置各不相同，但能產生相同的黏性末端，這類酶被稱為同尾酶。常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC四個核苷酸組成的黏性末端。顯而易見，由同尾酶所產生的DNA片段，是能夠通過其黏性末端之間的堿基互補作用而彼此連接起來。

【例1】 （2005年天津理綜）：限制性內切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性內切酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。在質粒上有酶Ⅰ的一個切點，在目的基因的兩側各有1個酶Ⅱ的切點。

①請畫出質粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②請畫出目的基因兩側被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？

解析：這兩種酶屬于同尾酶，能產生相同的黏性末端，因此能夠連接起來。

③由于兩者產生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之間能發生堿基互補配對而連接。

（4） 單酶切的優點與缺點。單酶切優點就是操作簡單。它的缺點主要有兩個：①酶切后的質粒與目的基因在DNA連接酶作用下易自身環化：用單酶切切割后的目的基因和質粒的兩側各有一個黏性末端，而且是相同的末端，因此這兩個末端會發生堿基互補配對而使目的基因和質粒分別發生首尾相連，都形成環狀DNA分子，其中質粒又恢復成沒有切割前的樣子。②目的基因與質粒的任意連接：因為目的基因的插入是要有正確的方向才能正確表達，如果載體和目的基因的酶切是使用同一種限制酶，那么目的基因的插入就有兩種可能了。一種可能是目的基因的最前端剛好插在啟動子鄰接下游，這樣可以正確表達；另一種剛好相反，目的基因的末端插在啟動子的鄰接下游（也就是將目的基因翻轉180度之后插入進去的），目的基因則沒有辦法表達。這樣就容易形成兩種重組DNA分子，其中一種重組DNA分子是我們所需要的，這樣就加大了篩選工作量。由此可見，將同一種限制酶切割目的基因與質?？梢垣@得兩種重組質粒，不能使質粒與目的基因發生定向連接。

2.多酶切

（1）用兩種或兩種以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段和運載體。較常見的是用同一組兩種限制酶去切割含目的基因的DNA片段和運載體，兩者都會產生具有兩種不同的黏性末端的DNA片段（兩個末端分別用A與B表示），然后混合起來，那么載體分子的A端與目的基因的A端連接，載體分子的B端與目的基因的B端連接，這就形成了重組DNA分子。另外，還可以用不同組限制酶同時去切割含目的基因的DNA片段和運載體，此時要用同尾酶或同裂酶去切割。

【例2】 （2009年福建理綜）：轉基因抗病香蕉的培育過程如下圖所示。質粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四種限制酶切割位點。請回答：

構建含抗病基因的表達載體A時，應選用限制酶，對進行切割。

解析：題中抗病基因的兩側分別是PstⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，因此只能用這兩種酶去切割。目的基因兩側的黏性末端是P和E，為了讓目的基因與運載體結合，運載體兩側的黏性末端也只能是P和E，因此也只能用PstⅠ和EcoRⅠ酶去切割質粒。不能單獨使用SmaⅠ酶去同時切割目的基因與質粒的原因是SmaⅠ的酶切位點正好在目的基因的中間，如果單獨用此酶切割會破壞目的基因的結構。因此，答案是選用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ對含抗病基因的DNA片段與質粒進行切割。

（2）多酶切的優缺點。多酶切的優點是可以克服單酶切的兩大缺點，一是可防止目的基因與質粒的自身環化：多酶切后目的基因與運載體的兩側的黏性末端不相同，因此不能發生自身首尾相連成環狀DNA分子。二是可實現目的基因與質粒的定向連接。比如說緊靠啟動子下游的是PstⅠ的酶切位點，而EcoRⅠ位點在后面，目的基因的前端是PstⅠ位點，末端是EcoRⅠ位點，酶切之后插進去，就可以保證目的基因的前端剛好插到緊靠著啟動子的下游，只產生一種重組質粒，目的基因實現定向插入，這樣就可以順利表達。2010年江蘇生物高考第27題的第4小題就考查了多酶切的優點。多酶切的缺點是要用多種酶切割，由于每種限制酶的作用的條件不同，或是說最適pH和溫度的不同，一般不能將一組的兩種酶放在同一操作環境中使用，而是要進行兩次操作，更換操作液，以保證酶的高效性。因此，使用多酶切的方法在實際操作中較復雜。

二、平位切割含目的基因的DNA片段和運載體──形成平末端

（1）用相同或不同的限制酶切割含目的基因的DNA片段和運載體。如果限制酶切割方式是平切，產生的末端是平末端，則可用相同或不同的限制酶分別切割含目的基因的DNA片段和運載體，因為兩個不同的平末端在DNA連接酶的作用下可以任意連接，具體的原因是DNA連接酶連接的僅僅是DNA雙螺旋結構外側的骨架，即磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵和堿基無關。在2008年江蘇生物高考第32題的第5小題中就有考查關于平末端任意連接的知識點。

（2）平位切割的優缺點。由于兩個不同的平末端在DNA連接酶的作用下可以任意連接，這樣就不需要含目的基因的DNA片段和運載體具有相同的限制酶識別序列，減少了對運載體的挑選和改造的工作量。而且對于非互補的黏性末端，可以采用綠豆核酸酶等將其單鏈削平或補齊，使它變成平末端，然后進行連接。在實踐中，極少用平末端，因為平末端的連接效率比較低，只有在找不到合適切成黏性末端的酶切位點而有平末端切口的情況下才使用。

總之，以上幾種酶切方法在近幾年的生物高考題中都有所體現，都有各自的優缺點，在解題時要根據題目中的要求進行酶切方法的選擇，要學會靈活運用知識，這樣才能在高考中拿到高分。

(責任編輯 杜 華）