考馬斯亮藍染色法測定大豆莖葉中蛋白質含量

楊正坤　王秀麗　龍施華　郝再彬　單展展　周菲菲

摘要：應用考馬斯亮藍染色法測定大豆莖葉中蛋白質含量。結果表明，該法測定大豆莖葉中蛋白質含量是可行的，其RSD為0.25%～1.27%，回收率為94.9%～106.4%，大豆莖葉蛋白質平均含量為7.673%和11.315%。該方法簡便快速，靈敏度高、重現性好、準確率相對較高，可用于微量可溶性蛋白質含量的測定。

關鍵詞：大豆莖葉；蛋白質含量；考馬斯亮藍染色法

中圖分類號：TS63文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4610-03

蛋白質是一項質量和資源評價的重要指標[1]，用一種快速、準確、方便的方法來檢測蛋白質含量是必不可少的。近年來，許多學者用考馬斯亮藍染色法和其他方法對蛋白質含量進行了測定[2-9]。蛋白質中的酰胺基團與考馬斯亮藍染料中的陰離子結合使溶液顯藍色，測定效果可通過測定顯色穩定性等多個性狀指標進行全面客觀地評價。本試驗采用盆栽大豆，對大豆的莖葉蛋白質含量與大豆產量進行考察，通過分析它們之間的影響與關系，為今后大豆育種工作提供試驗方法。

1材料與方法

1.1材料

供試樣品為大豆莖葉（實驗室自制）。

牛血清白蛋白（進口分裝），購于上海億欣生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250（進口分裝），購于中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2儀器

SHB-IIIS循環水式多用真空泵和抽濾裝置（鄭州長城科工貿有限公司）、EL303型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Cary50紫外分光光度計（美國瓦里安有限公司）。

1.3方法

1.3.1蛋白質標準溶液的配制 準確稱取牛血清白蛋白100.0 mg，用去離子水定容至100 mL，即為

1 mg/mL蛋白質標準液，4 ℃保存待用。

1.3.2考馬斯亮藍G-250溶液的制備稱取考馬斯亮藍G-250 100.0 mg于研缽中，取體積分數為95%的乙醇（下同）50 mL，從中取約10 mL加入研缽，將考馬斯亮藍G-250研成粉并溶解；輕輕將上層液體轉入500 mL燒杯中，再取10 mL乙醇溶液于研缽中研磨，同法收集，重復洗滌3次。最后用20 mL乙醇分次洗滌研缽，合并液體于燒杯中。取體積分數為85%濃磷酸100 mL分次加入燒杯再轉入

1 L容量瓶，定容，抽濾，得考馬斯亮藍G-250溶液。

1.3.3標準曲線的繪制分別吸取0.2～1.0 mL標準蛋白質溶液于10 mL試管中，各管補加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管中并加入5 mL考馬斯亮藍 G-250溶液，搖勻，放置 2 min，于595 nm 處測定其吸光度[7]。

1.3.4樣品中蛋白質含量的測定取樣品溶液0.1 mL，按上述方法測定其吸光度，再根據標準曲線方程計算出樣品的蛋白質含量[8]。

2結果

2.1標準曲線回歸方程的建立

用紫外分光光度計，以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白對照，在595 nm處測定對照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，繪制標準曲線見圖1。

通過測定不同濃度牛血清白蛋白的吸光度得其線性回歸方程式：Y=0.478 3X+0.070 3，R2=0.999 3。

2.2樣品蛋白質含量測定結果

按蛋白質含量測定方法，同時做3個重復，大豆莖的吸光度為0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.，大豆葉的吸光度為0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。計算大豆莖的蛋白質含量為7.608%、7.734%和7.677%，平均含量為7.673%；大豆葉的蛋白質含量為11.313%、11.305%和11.328%，平均含量為11.315%。

2.3穩定性試驗

量取同一樣品溶液 1 mL，每隔 10 min 測定1次，觀測其穩定性，結果見表1，表明在顯色1 h 內吸光度穩定，RSD分別為0.04%和0.39%。

2.4重復性試驗

按上述方法，分別測定大豆莖和葉蛋白提取液的吸光度，檢驗該方法的重現性，結果見表2，RSD分別為0.83%和1.27%，小于5%，表明重現性較好。

2.5精密度試驗

準確吸取牛血清白蛋白溶液（1 mg/mL）0.5 mL進行精密度試驗，連續測定其吸光度6次，其RSD為0.25%，小于5%，表明精密度較好，結果見表3。

2.6回收率測定

取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL，加入1 mL大豆莖（或葉）樣品溶液，然后再加入5 mL考馬斯亮藍染色液，搖勻，靜置2 min左右，于595 nm處測定其吸光度，以不加牛血清白蛋白溶液作為空白對照，根據標準曲線算出相應濃度，然后計算加入樣品蛋白的量，并計算回收率[9]，結果見表4。結果表明，該方法準確度較高，可滿足大豆莖葉中蛋白含量的快速定量分析。

3討論

蛋白質分子均具有酰胺基團，棕紅色的考馬斯亮藍G-250染料上的陰離子與蛋白質的酰胺基團結合，使溶液變為藍色，由于溶液在595 nm處吸光度與蛋白質含量成正比，因此595 nm處測定吸光度，可計算出樣品中蛋白質含量[6]。上述結果表明，考馬斯亮藍與蛋白質中的酰胺基團結合生成的藍色非常穩定，在1 h之內吸光度值變化很小，重復性較好，精密度較高，同時該方法測定蛋白含量的回收率符合大豆莖葉蛋白質含量的測定要求。大豆莖蛋白質提取液中蛋白質含量在0.7～1.0 mg/mL范圍內；大豆葉蛋白質提取液中蛋白質含量在1.1～2.0 mg/mL范圍內，用考馬斯亮藍染色法測定大豆莖葉蛋白質的含量優于其他傳統方法[10，11]。但另一方面，該法線性范圍窄，低濃度樣品易受影響，因此，在測定時所用試管須經酸浸泡，洗凈后應經高溫烘干。當樣品濃度大于一定濃度時，須稀釋測定，另外，可用乙醇和去離子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。綜上所述，該法準確率較高且簡便靈敏，對設備要求低，受干擾小，適宜于測定大豆莖葉的蛋白質含量。

參考文獻：

[1] 王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：40-41.

[2] 馬丹.凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量[J].計量與測試技術，2008，35（6）：57-58.

[3] 孫士青，王少杰，李秋順，等.考馬斯亮藍法快速測定乳品中蛋白質含量[J].山東科學，2011，24（6）：53-55.

[4] 馮昕，王吉中，堯俊英，等.考馬斯亮藍法測定乳與乳制品中蛋白質含量[J].糧食與食品工業，2010，17（3）：57-59.

[5] 黃婉玉，曹煒，李菁，等.考馬斯亮藍法測定果汁中蛋白質的含量[J].食品與發酵工業，2009，35（5）：160-162.

[6] 王文平，郭祀遠，李琳，等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量[J].食品研究與開發，2008，29（1）：115-117.

[7] 裴顯慶.用考馬斯亮藍染色方法測定蛋白質含量[J].肉類研究，1990（1）：36-37.

[8] 李娟，張耀庭，曾偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，13（2）：118-120.

[9] 劉小華，張美霞，于春梅，等.考馬斯亮蘭法測定殼聚糖中蛋白的含量[J].中國交通醫學雜志，2006，20（2）：159-160.

[10] 王愛軍，王鳳山，王友聯，等.低濃度蛋白質含量測定方法的研究[J].中國生化藥物雜志，2003，24（2）：78-80.

[11] 王淡兮，孫秀蘭.蛋白質定量檢測方法的探討[J].糧食與食品工業，2009（4）：49-52.

[12] 徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍法測定微量蛋白的條件探討[J].江西醫學檢驗，2003，21（5）：353-354.