提取甲殼素的乳酸菌發酵工藝優化

陳亞

摘要：以地產克氏螯蝦（Procambarus clarkii）蝦殼為原料，采用乳酸菌（Lactococcus lactis）發酵的方法提取甲殼素，并對發酵工藝進行優化研究。結果表明，發酵的最佳工藝組合為發酵溫度37 ℃，發酵時間96 h，葡萄糖加入量5%，固液比1.0∶3.0（m/V，g∶mL），發酵起始pH 5.5。采用上述組合，所得甲殼素產率達13.9%。該工藝具有顯著的經濟效益和社會效益，具有良好的應用前景。

關鍵詞：甲殼素；制備；乳酸菌（Lactococcus lactis）發酵；克氏螯蝦（Procambarus clarkii）蝦殼

中圖分類號：Q815文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4607-03

甲殼素（Chitin）又名幾丁質、殼多糖、甲殼質、聚乙酰氨基葡萄糖等，化學名稱為（1，4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，分子式為（C8H13NO5）n，它是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接的一種乙酰氨基葡萄糖。甲殼素是人類繼發現淀粉、纖維素之后在地球上發現的第三大生物資源，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等動物的外殼及植物的細胞壁中，是一種重要的天然高分子多糖。在甲殼素被發現的一個多世紀以來，人們對該類化合物進行了大量的基礎研究和應用研究，揭示了其在醫藥、農業、日化、輕紡、環保等領域廣泛的應用價值[1-3]。

目前，國內外主要采用傳統的化學方法生產甲殼素，生產工藝相對簡單，但生產過程中大量使用強酸、強堿會導致嚴重的環境污染，同時造成水資源的嚴重浪費。可以說，高污染及浪費水資源已成為影響甲殼素產業生存與發展的瓶頸，嚴重制約了該產業的持續健康發展。而采用生物工藝，即通過微生物的發酵作用代替化學工藝制備甲殼素，正成為甲殼素生產工藝研究的熱點[4，5]。

本研究以地產克氏螯蝦（Procambarus clarkii）（俗稱小龍蝦）蝦殼為原料，采用乳酸菌（Lactococcus lactis）純種發酵的方法制備甲殼素，以期為甲殼素這一重要生物資源的更好利用以及中國甲殼素生產企業的技術革新提供新的有效途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料選新鮮、雜質少、無霉變腐爛和蟲蛀現象的地產克氏螯蝦蝦殼為原料。

1.1.2菌株菌株為鹽城師范學院生命科學與技術學院保藏的乳酸菌種。

1.1.3培養基MRS液體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO4 2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 0.1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，用去離子水定容至1 000 mL；脫脂乳培養基為市售鮮牛乳。

1.1.4主要儀器KYC-100C空氣恒溫搖床購自上海福瑪實驗設備有限公司，101-A電熱鼓風干燥箱購自上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司，FA1604電子天平購自上海良平儀器儀表有限公司，PHS-3C型pH計購自上海雷磁儀器廠。

1.2方法

1.2.1菌種的活化將保存的乳酸菌菌種用新鮮滅菌脫脂乳活化1代，于37 ℃培養過夜至牛乳凝固，再以體積分數為1%的接種量轉接于MRS液體培養基中，于37 ℃培養過夜，重復活化2～3代，直至菌種恢復活力，冷藏備用。

1.2.2發酵液的制備吸取活化的菌液以體積分數為1.5%的接種量轉接于MRS液體培養基中，于37 ℃培養12 h至培養液渾濁，冷藏備用。

1.2.3原料的預處理地產克氏螯蝦蝦殼經清洗和去除雜質，于105 ℃干燥4 h，用絞肉機絞碎備用。

1.2.4發酵試驗稱取經預處理的地產克氏螯蝦蝦殼100 g，置于500 mL三角燒瓶中，加入葡萄糖、發酵液。將燒瓶置于空氣恒溫搖床中，設置轉速為250 r/min，進行發酵試驗。發酵結束后過濾，用去離子水漂洗至中性，于105 ℃烘箱恒溫干燥4 h，即得到白色固態的甲殼素。根據影響發酵進程的因素，以甲殼素產率為分析指標，分別對發酵溫度、發酵時間、葡萄糖加入量、固液比和發酵起始pH進行單因素試驗，篩選單因素的最佳條件。

2結果與分析

2.1發酵溫度

溫度是影響細菌生長繁殖和發酵產物質量的重要因素之一[6]。發酵溫度不同，甲殼素產率亦明顯不同（表1）。

一般而言，菌體濃度與甲殼素產率成正相關。若發酵溫度過低，菌體生長緩慢，菌體濃度不高，從而影響甲殼素產率。若發酵溫度過高，菌體培養后期容易衰老而自溶，菌體濃度亦不高，也會影響甲殼素的提取。由表1可知，在一定范圍內，甲殼素的產率隨發酵溫度的升高而增加，在37 ℃時達到最大，為13.7%，繼續提高發酵溫度，甲殼素產率反而下降，故選擇發酵溫度為37 ℃。

2.2發酵時間

發酵時間對反應進行的程度、甲殼素的產率和質量也有較大影響。由表2可知，隨著發酵時間的增加，甲殼素產率隨之上升，當發酵時間為96 h時，甲殼素產率達13.8%。繼續延長發酵時間，甲殼素產率上升不明顯。故綜合考慮設備利用率、發酵成本等因素，選擇96 h作為較好的發酵時間。

2.3葡萄糖加入量

微生物生長繁殖需要一定的碳源，而碳源的濃度對微生物發酵有明顯影響。碳源過于豐富，易引起菌體異常繁殖，對菌體代謝、產物合成及氧的傳遞不利；反之，如果僅僅供給維持量的碳源，則菌體的生長和代謝均受到抑制。以葡萄糖作為乳酸菌發酵的碳源，其加入量與甲殼素產率的關系如表3。由表3可知，葡萄糖加入量為5%時，甲殼素產率最高，發酵效果最好。

2.4固液比

在發酵試驗中，加入足量的發酵液將原料蝦殼完全浸沒，是原料發酵充分、提高甲殼素產率的前提。試驗結果顯示，固液比（m/V，g∶mL，下同）為1.0∶3.0時，可將蝦殼表面浸沒。因此，研究時分別將固液比設定為1.0∶3.0、1.0∶3.5和1.0∶4.0，研究發現3種固液比下甲殼素產率無明顯變化，而發酵時固液比加大，發酵過程中生產用水、發酵殘液的總量會隨之增大，造成成本增加和副產物深度回收的困難，因而選擇的最適固液比為1.0∶3.0。

2.5發酵起始pH

乳酸菌在酸性環境中具有較高的活力，采用乳酸菌發酵的方法提取甲殼素，起始pH對甲殼素產率有一定影響（表4）。由表4可知，pH 5.5時甲殼素產率最高，為13.9%，因此選擇pH 5.5為最佳的發酵起始pH。

2.6發酵工藝的優化

采用上述優化的發酵條件：發酵溫度37 ℃、發酵時間96 h、葡萄糖加入量5%、固液比1.0∶3.0、發酵起始pH 5.5，利用乳酸菌發酵的方法制備甲殼素，得到甲殼素產率為13.9%，產品質量符合市售甲殼素的質量指標。

3小結與討論

甲殼素作為重要的生物資源，其生產原料主要來自于蝦、蟹殼等，蝦殼中甲殼素含量約為15%～20%[7，8]。長期以來，人們主要通過化學方法，即采取強酸、強堿處理的方法開展甲殼素提取工藝的研究與應用，例如，鄭鐵生等[8]以地產龍蝦殼為原料，探討甲殼素提取和殼聚糖制備的方法，其甲殼素得率為14.8%。項東升等[9]以地產龍蝦殼為原料，對采用化學方法提取甲殼素的工藝進行優化，使甲殼素得率達到15.0%，并對甲殼素提取過程中產生的廢液的處理做了有益的嘗試，取得了較好的經濟效益和環境效益。而Rao等[10]分別以蝦頭和蝦殼為原料，采用乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵的方法提取甲殼素，甲殼素得率分別為4.5%和13.0%。

本研究以經預處理的地產克氏螯蝦蝦殼為原料，對發酵條件進行了優化，得到優化的發酵條件為發酵溫度37 ℃、發酵時間96 h、葡萄糖加入量5%、固液比1.0∶3.0、發酵起始pH 5.5。該條件下所得甲殼素產率為13.9%，其質量符合市售甲殼素的質量指標。雖然研究中甲殼素的產率略小于上述化學工藝的研究報道，但采用乳酸菌等微生物發酵的生物工藝提取、生產甲殼素，無需大量使用強酸、強堿，反應條件溫和，而且節約水資源，可以顯著降低生產成本，減少環境污染。特別值得一提的是，蝦殼中除了含有豐富的甲殼素，還富含蛋白質、氨基酸、多肽、脂肪和礦物質等營養物質，目前生產上在提取獲得甲殼素后，往往將這些有用物質隨同生產廢渣廢液一起排放到環境中，既造成資源浪費，又產生環境污染。而采用微生物發酵的方法提取甲殼素，可以最大限度地減少有害化學物質的殘留，使甲殼中其他有用營養物質的回收利用成為可能，有利于原料的綜合利用。

地產克氏螯蝦蝦殼是水產品加工的廢棄物，同時又是一種重要的動物性再生資源。本研究以地產克氏螯蝦蝦殼為原料，采用乳酸菌發酵的方法制備甲殼素，證明通過乳酸菌等微生物發酵生產甲殼素，具有顯著的經濟效益和社會效益，具有良好的應用前景。

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