后溝堡子酒酒曲優勢細菌的初步分離與鑒定

趙文婧　石瑛　王瑞祥　單樹花

摘要：從山西省晉中市榆次區后溝堡子酒酒曲樣品中初步分離純化出2株細菌XJ1和XJ2，通過形態觀察以及生理生化反應分析得出，XJ1白色、中等大小、圓形、菌落呈放射狀，XJ2呈乳白色、形狀規則、表面呈粉末狀、較致密。通過生理生化試驗得出，兩株細菌的吲哚試驗、甲基紅試驗同呈陽性，兩株細菌均能利用葡萄糖和半乳糖，均不能利用蔗糖，XJ1革蘭氏染色呈陽性，XJ2革蘭氏染色呈陰性。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》可以得出這兩株菌株分別是乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬。

關鍵詞：堡子酒；大曲；細菌；分離

中圖分類號：Q93-331文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4604-03

酒類是中國第一大類發酵食品，現在人們視高度白酒為慎用食品，而低度、開胃助消化、營養豐富且具有保健功能的釀造酒已成為人們追求的目標。用曲釀酒是中國酒的特色，在世界釀酒史上獨樹一幟，是中國的一項偉大發明[1]。日本著名釀酒專家板口謹一郎先生曾經評論，中國發明酒曲釀酒，其影響之大，堪與中國四大發明相比[2]。在現代大致將酒曲分為五大類，麥曲、小曲、紅曲、大曲、麩曲，分別用于制作不同的酒。探索酒曲發酵的奧妙，從而揭示其釀酒發酵機理，以利于更有效地指導生產，進行質量控制，改良酒體風格[3]。

縱觀世界各國的釀酒史發現，用谷物原料釀酒的技術主要有兩大類，一類是以谷物發芽的方式，利用谷物發芽時產生的酶將原料本身糖化成糖分，再用酵母菌將糖分轉變成酒精；另一類是用發霉的谷物制成酒曲，用酒曲中所含的酶制劑將谷物原料糖化發酵成酒。傳統的酒曲本質之一就是粗酶制劑，但傳統的酒曲的最大缺點是酶活較低。在現代由于酶制劑工業的發展，在酒的生產過程中適當加入一部分酶制劑以代替部分傳統酶制劑的使用可降低酒的生產成本，但所產生的問題是酒的香味受到一定的影響。

白酒生產微生物是影響產品質量風格的重要因素之一，不同區域的地理環境存在眾多不同的微生物菌群。淡雅濃香型白酒應有己酸乙酯為主的復合香氣，凸顯幽雅飄逸感，口味應努力做到綿柔、醇和、回甜、爽凈，具有舒適感；在風格上注重色、香、味的自然諧調感，具有獨特淡雅的風格。白酒生產技術是中國勞動人民和科學工作者對世界釀酒工業的特殊貢獻。其獨特的多種微生物固態發酵釀酒、甑桶蒸餾及其生產工藝形成了白酒的各種風格[4]。白酒的特殊風味來源于參與白酒發酵的微生物種類和數量的多寡，謂之“曲者，酒之骨也。”釀酒原料在微生物的作用下生成各種呈香味物質，所以微生物的種類又是關鍵因素。由于微生物之間存在著互生、共生、寄生、拮抗的關系，在白酒生產過程中逐漸形成一個靠自然給予、異常復雜并與環境相適應的微生物區系。這種區系的存在在很大程度上決定白酒的風格。

本研究采用的酒曲樣品來源于山西省晉中市榆次區后溝堡子酒酒廠。該酒廠以當地盛產的高粱為主料，谷糠為輔料，大麥、豌豆踩制的大曲為糖化發酵劑，利用地缸固體分離發酵和清蒸二次傳統工藝進行釀造，釀制出了原有風味的堡子酒。大曲中含有細菌、霉菌、酵母菌等多種微生物，因此發酵過程極為復雜，各種微生物的生理性能不同，其作用也各異。探討堡子酒酒曲中細菌的生化活性，通過微生物平板分離純化技術，采用稀釋、涂布、恒溫培養、生理生化等試驗，對酒曲中的細菌進行初步分離鑒定，從而揭示堡子酒發酵過程中的細菌種類，為優化酒質量，改善酒質，提高堡子酒營養價值，開發堡子酒系列新品種提供參考。

對于國內研究酒曲細菌分離和鑒定的試驗來說，堡子酒的研究屬于首例，對于堡子酒本身來說填補了其空白，為堡子酒品質的提高提供依據；另一方面堡子酒屬于清香型白酒，它和汾酒同屬一個系列，該項研究提升堡子酒本身價值的同時，也為國內清香型白酒的研究做了一定的補充。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料后溝堡子酒酒曲由山西省晉中市榆次區后溝堡子酒酒廠提供。

1.1.2儀器與設備海爾HRCJ-2D型無菌操作臺、海爾HRSP-250H型恒溫培養箱和海爾搖床購自上海富眾生物科學有限公司，CL-32L型滅菌鍋購自日本ALP，MP4002型電子天平購自上海恒平科學儀器有限公司，H5-1型磁力加熱攪拌器購自鄭州長城儀器有限公司。酒精燈、接種環、研缽、紗布、棉花、繩子、三角玻璃棒、1 000 mL燒杯、中號試管、9 cm培養皿、500 mL錐形瓶、1 mL移液管、玻璃珠、德漢氏小管。

1.1.3試劑牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、蔗糖、半乳糖、淀粉、甲基紅、乙醚、對甲基苯甲醛、濃鹽酸、溴甲酚紫、無水乙醇、95%乙醇、碘化鉀、碘均為分析純。

1.1.4固體培養基和液體培養基牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g，用去離子水定容到1 000 mL，pH 7.4～7.6；淀粉培養基：蛋白胨10 g、可溶性淀粉2 g、氯化鈉

5 g、瓊脂15～20 g、牛肉膏5 g，用去離子水定容至

1 000 mL，pH 7.2；糖發酵液體培養基：蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、半乳糖10 g、16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，用去離子水定容到

1 000 mL，pH 7.4；吲哚培養基：蛋白胨10 g、氯化鈉

5 g，用去離子水定容到1 000 mL，pH 7.6；甲基紅（MR）培養基：蛋白胨5 g、磷酸氫二鉀5 g、葡萄糖

5 g，用去離子水定容到1 000 mL，pH 7.2～7.4；蛋白胨水培養基：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g，用去離子水定容到100 mL，pH 7.8；葡萄糖蛋白胨水培養基：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g，用去離子水定容到100 mL，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.1細菌分離與鑒定的流程榆次后溝堡子酒酒曲中細菌分離與鑒定的流程如下：酒曲菌懸液→平板分離→菌種純化→生理生化試驗→鑒定→檢索→結論。

1.2.2菌懸液的制備稱取樣品1 g，加入到裝有9 mL無菌去離子水的錐形瓶內（內有小玻璃珠），用搖床振蕩20 min，菌懸液即制備完成。

1.2.3細菌的分離純化

1）梯度濃度菌懸液的制備。用無菌吸管從菌懸液中吸取1 mL菌液，加入到裝有9 mL無菌去離子水的試管中充分混勻，然后從該試管中吸取1 mL菌液加入到另一支裝有9 mL無菌去離子水的試管中，混合均勻，依此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、

10-5、10-6不同稀釋梯度的菌懸液。

2）細菌的分離。細菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養基[5]，取不同梯度的菌懸液0.1 mL，分別加入到無菌平板中，用涂布棒涂勻，使樣品溶液在培養基上分布均勻。放入37 ℃恒溫培養箱中培養大約24 h至長出菌落[5]。

3）細菌的純化。用接種環按無菌操作法分別從平板培養基上挑取一接種環不同形態的菌落，在新的牛肉膏蛋白胨培養基中進行劃線分離，分別放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后進行觀察。重復以上操作至培養基上出現單一菌落為止，將純化得到的菌種進行編號并分別接種于牛肉膏蛋白胨培養基，繼續于37 ℃恒溫培養。

1.2.4細菌的鑒定根據經典微生物分類法[6]對細菌進行分類，主要是依據細菌形態學、生理學和生態學特征對細菌進行初步分類，并對菌種的形態特征（如群體特征和個體特征）和生理生化特征進行鑒定[7]。

1）細菌的群體形態學觀察[8，9]。細菌的培養特征是指細菌在培養基上的形態和生長習性，主要觀察菌落的形狀、顏色、大小、透明度、光澤質地、邊緣情況及隆起情況等，并記錄結果。

2）細菌個體形態的觀察。在高倍鏡及油鏡下分別對獲得的單一菌株的個體形態、大小、革蘭氏染色、運動性、鞭毛的有無等進行觀察[10]，并記錄結果。

3）細菌生理生化反應的觀察。主要觀察細菌的營養源利用情況，代謝特征，能否產酸、產氣以及生長發育條件等，對純化的菌株進行淀粉水解試驗、糖發酵試驗、MR試驗、吲哚試驗[10，11]等檢測各項生理生化指標。

2結果與分析

2.1細菌的分離結果

從堡子酒酒曲中分離并純化出2株細菌，分別命名為XJ1和XJ2，主要用于觀察兩株細菌菌落的形狀、顏色、大小、透明度、光澤質地、邊緣情況及隆起情況等。

2.2細菌的鑒定結果

2.2.1細菌菌落形態鑒定結果由表1可知，酒曲中的細菌分別為白色和乳白色兩種，XJ1半透明、菌落呈放射狀，XJ2表面呈粉末狀、較致密。

2.2.2細菌個體形態鑒定結果由表2可知，XJ1為革蘭氏陽性菌，XJ2為革蘭氏陰性菌；兩株細菌的形狀均為桿狀且都有莢膜；XJ1無芽孢，XJ2有芽孢。

2.2.3細菌生理生化鑒定結果對細菌進行各項生理生化測定，所得結果見表3和表4。XJ1和XJ2的吲哚試驗均為陽性，MR試驗均為陽性，淀粉水解試驗中XJ1為陰性、XJ2為陽性，糖發酵試驗中XJ1和XJ2均能利用葡萄糖和半乳糖，均不能利用蔗糖。

3小結與討論

該研究通過對后溝堡子酒酒曲進行分析處理、稀釋培養、分離純化后，根據菌種鑒定文獻[5，12]鑒定得到2株細菌XJ1和XJ2。

生理生化反應當中，兩株細菌均能利用葡萄糖和半乳糖作為碳源，但均不能利用蔗糖作為碳源，這說明不同的細菌能通過分解不同的糖類來獲取其生長所需的營養物質。兩株細菌在分解葡萄糖和半乳糖時均只產酸而不產氣。兩株細菌在進行吲哚試驗時均能產生色氨酸酶，它可以分解蛋白胨中的色氨酸，從而產生吲哚和丙酮酸。XJ1對淀粉無分解能力，而XJ2對淀粉有分解能力。

根據其形態觀察和生理生化試驗結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]可初步檢索得出2株菌株的所屬菌屬，XJ1為乳酸桿菌屬，XJ2為芽孢桿菌屬。

酒中的眾多香味成分來源于細菌代謝[14，15]。此次試驗初步得出了酒曲中細菌的種類，為優化酒質量，改善酒質，提高堡子酒營養價值，開發堡子酒系列新品種提供了科學根據。堡子酒和山西汾酒同屬清香型白酒，國內對汾酒的研究已非常廣泛，而堡子酒尚屬首例，本研究填補了堡子酒研究的空白，并可以充實和完善山西清香型白酒的系統研究。

對酒曲中存在的細菌進行了研究，涉及其分離純化和初步鑒定，并確定到屬。在以后的研究中將采用分子生物學方法對未知菌進行進一步的菌種鑒定。通過對微生物的16 S rDNA序列分析等，從基因水平對酒曲微生物進行定性和定量研究，直接、微觀地探討微生物種群結構、遺傳多樣性及其與環境間的相互關系，對酒曲進行更深層次的研究，為酒曲生產工藝的改進提供理論支撐。

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