云南高原濕地植物水蔥的ITS序列分析

于瑤　張漢堯　杜建偉

摘要：提取分布于云南高原濕地的水蔥（Scirpus validus Vahl.）樣品的DNA，采用ITS 序列擴增通用引物，對其進行PCR 擴增，并對PCR產物進行測序。從GenBank搜索并下載水蔥屬其他種類的ITS序列，并通過BioEdit、ClustalX 2.02和MEGA 4x1軟件分析和構建系統發育樹。分析結果揭示了水蔥屬14個種之間的親緣關系，并確定了樣品在種間的位置以及和其他種的親緣關系。

關鍵詞：水蔥（Scirpus validus Vahl.）；ITS序列；系統發育樹

中圖分類號：Q523+.8；Q949.71+4.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）20-4549-02

濕地生態系統是一類重要的自然生態系統，中國云貴高原、青藏高原分布著不同海拔的高原濕地。植被和植物群落特征是顯示高原湖泊濕地的自然性、特殊性、多樣性、演變階段、消退階段的最好指示要素。水蔥是云南高原濕地挺水植被群落中常見的分布最為廣泛的優勢群落。水蔥的拉丁學名為Scirpus validus Vahl.，為莎草科多年生宿根挺水草本植物，生長在湖邊、水邊、淺水塘、沼澤地或濕地草叢中，在中國南北方分布廣泛，是構建人工濕地系統、進行污水凈化的常用挺水植物，也是常用的景觀綠化植被。

ITS序列是在rDNA基因中16 S rDNA和28 S rDNA基因的間隔序列，也被稱為內轉錄間隔區，ITS 序列在被子植物中的長度變異很小，承受的選擇壓力較小，相對變化較大，并且能夠提供詳盡的系統學分析所需要的可遺傳性狀。因此，其常被用于研究被子植物系統發育關系，尤其是近緣屬間及種間關系[1-3]。ITS序列和matK、rbcL序列[4]一樣都是在研究物種遺傳多樣性、系統發育、物種起源及物種確定上常用的依據[5-8]。

本研究以分布于云南高原濕地中的水蔥為樣品，通過克隆其基因組DNA的ITS片段，并與NCBI上已收錄的其他水蔥屬各種植物的ITS序列比較。明確其在水蔥屬各種間的系統發育樹上的位置，為水蔥的遺傳改良及研究水蔥屬種間的系統發育提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料采集于云南省大理州劍川縣的劍湖。采集地水蔥株高1～2 m，莖桿高大通直，桿呈圓柱狀，中空，多散生。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取采用新鮮幼嫩的水蔥水上部分，放入液氮中研磨成粉末，用生工生物工程（上海）股份有限公司的植物基因組提取試劑盒提取高質量的水蔥總DNA。

1.2.2PCR擴增參考文獻[8]，PCR反應體系包括由北京百泰克生物技術有限公司合成的ITS通用引物JK5.8F（5′-GAT ACT TGG TGT GAA TTG CAG A-3′）、ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）各2 μL，雙鏈DNA模板2 μL，北京百泰克生物技術有限公司生產的2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，用去離子水補足至50 μL。擴增條件為：95 ℃預變性6 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環；最后于72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE電泳緩沖液中電泳，電壓不超過5 V/cm，用溴化乙錠（EB）浸染，在UVP凝膠成像儀上觀察并攝影。用回收試劑盒回收純化擴增片段，純化后直接作為測序用模板。

1.2.3DNA的序列分析首先用BioEdit軟件對測序結果進行調整，轉換格式，利用ClustalX 2.02軟件完成DNA序列的對比，保存ALN格式，然后運用MEGA 4x1軟件進行系統發育分析，應用自展法（Bootstrap，1 000 Replicates）進行可信度檢測，對空位做缺失處理，使用1 000次重復抽樣計算鄰接樹（Neighbor-joining tree，NJ），模型選擇核算P-distance，構建水蔥屬各種之間的系統發育樹。

2結果與分析

2.1樣品PCR擴增后的電泳結果

采集水蔥樣本，提取基因組DNA，用PCR擴增后獲得了單一的目的條帶，獲得的樣品的ITS區域的序列片段長度為500 bp，PCR擴增獲得的目的片段為5.8 S rDNA片段、大部分ITS2和少量ITS1片段。在GenBank中利用BLAST對比獲得水蔥屬的其他相關種的ITS序列共計13個（表1）。

2.2樣品ITS的序列分析結果

由于本試驗擴增出來的為樣品的ITS部分片段，所以在經軟件ClustalX 2.02和MEGA 4x1分析時均選用水蔥屬中各種的相同ITS片段進行序列分析，分析結果表明，本試驗所用的14種水蔥屬的植物樣品的ITS片段有364個核苷酸位點，263個恒定信息位點，98個變異信息位點，51個簡約信息位點，46個單個堿基變化位點。該序列的變異信息位點所占比例僅為26.9%。說明水蔥的ITS序列變異不大，而且具有較多的遺傳信息，適用于進行遺傳分析。

2.3水蔥屬植物ITS序列的聚類分析結果

用ClustalX 2.02軟件對14個樣本的ITS序列進行了聚類分析，建立了其系統發育樹（圖1）。從聚類分析結果來看，可以把水蔥屬這14個樣本分為兩大分支，其中Schoenoplectus gitriqueter（三棱水蔥）、S. nipponicus和本試驗樣品為一個分支，其余各樣本為一個分支，其中本試驗樣品與S. gitriqueter親緣關系最近，并且又與S. nipponicus聚為一類。但本試驗樣本與S. gitriqueter的自展支持率為100%，所以確定為一個獨立的類群。

3討論

水蔥作為中國高原濕地中常見的分布廣泛的挺水優勢群落，是很好的環境指示植物，并對于濕地水體凈化、水生植被演替都有重要的意義，同時也是重要的濕地景觀植物。但國內外相關研究卻較少。水蔥屬有很多種類，但都沒有系統歸類和鑒別，如研究所檢索到的這14種都沒有很好的中文譯名和鑒別。特別是關于水蔥的分子生物學的研究，屬內各種的明確定位以及遺傳關系基本空白。通過ITS序列分析可知，本試驗樣品雖然與三棱水蔥親緣關系最近，但自展支持率為100%，所以很可能是一個獨立的類群。希望以后有更多的關于水蔥屬植物以及其他高原濕地植物的研究，以豐富中國高原濕地植被的知識，為中國高原濕地植物的保護和利用奠定分子生物學基礎。

參考文獻：

[1] 王建波，陳家寬.核rRNA的ITS序列在被子植物系統與進化研究的應用[J].植物分類學報，1999，37（4）：407-416.

[2] 王小全，洪德.植物分子系統學近五年的研究進展概況[J].植物分類學報，1997，35（5）：465-480.

[3] 趙志禮，董輝.核糖體DNA ITS區序列在植物分子系統學研究中的價值[J].植物資源與環境學報，2000，9（2）：50-54.

[4] 李曉賢，周浙昆.單子葉植物高級分類階元系統演化：matK、rbcL和18 S rDNA序列的證據[J]. 植物分類學報，2007，45（2）：113-133.

[5] 史全良，諸葛強，黃敏仁，等.用ITS序列研究楊屬各組之間的系統發育關系[J].植物學報，2001，43（3）：323-325.

[6] 劉華晶，許修宏，姜廷波，等.基于ITS序列分析探討大興安嶺地區野生黑木耳菌株的遺傳多樣性[J].四川農業大學學報，2011， 29（1）：41-44.

[7] 趙衛國，潘一樂，張志芳. 桑屬植物ITS 序列研究與系統發育分析[J].蠶業科學，2004，30（1）：11-13.

[8] 趙志國.基于生物信息技術對部分禾本科植物系統分類研究[D].山西太谷：山西農業大學，2005.