腸易激綜合征大鼠腸神經系統內γ—氨基丁酸及其受體的表達

陳鵬　胡立華　張艷杰　常英娟　張鑒穎

[摘要] 目的 通過研究γ-氨基丁酸（GABA）及其受體在便秘型腸易激綜合征（C-IBS）大鼠模型腸神經系統中表達的變化，探討GABA在腸易激綜合征（IBS）發病機制中的可能作用。 方法 通過0～4℃冰水灌胃方法建立C-IBS大鼠模型，分別取模型組和正常對照組大鼠的回盲部以及距肛門3cm處結腸的標本，進行灌注、固定、切片。用抗谷氨酸脫羧酶（GAD）、GABAA受體、GABAB受體抗體進行免疫組織化學染色，應用病理圖像分析系統對不透光率密度值進行半定量分析。 結果 與正常大鼠相比，C-IBS大鼠模型回盲部及距肛門3cm處結腸肌層中GAD免疫反應性明顯降低（P < 0.05），GABAA受體免疫反應性無明顯變化（P > 0.05），GABAB受體免疫反應性明顯降低（P < 0.05）。 結論 GABA可能通過其受體間接地參與IBS的病理生理過程。

[關鍵詞] 腸易激綜合征；腸神經系統；γ-氨基丁酸；γ-氨基丁酸受體

[中圖分類號] R574.4[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）21-0015-03

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是由腹部不適或腹痛伴排便異常組成的一組腸功能障礙性綜合征，目前發病原因尚不清楚，缺乏有效的治療方法[1]。腸神經系統（enteric nervous system，ENS）是胃腸壁內的自主神經系統，具有獨立于大腦而行使其功能的完整結構。ENS中含有多種神經遞質，近年來的研究結果表明在IBS動物模型的腸神經元VIP、SP等神經遞質表達增強[2]，而IBS患者血中NO、5-HT、SP[3，4]等也發生了變化，提示ENS中的神經遞質與IBS的發病機制存在一定關系。γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是中樞神經系統內重要的抑制性神經遞質，通過受體（包括GABAA、GABAB、GABAC等亞型）發揮重要的調節作用。谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase， GAD）為GABA合成過程中的關鍵酶，被認為是GABA能神經元的特異性標記酶。但迄今為止，關于GABA及其受體在腸易激綜合征中的表達變化尚不清楚。本研究利用冰水洗胃方法建立的便秘型腸易激綜合征（C-IBS）大鼠模型[5]，應用免疫組織化學方法及圖像分析系統半定量分析對正常及C-IBS大鼠ENS內GAD、GABAA受體、GABAB受體的表達變化進行研究，以探討GABA在IBS發病過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立

SD大鼠10只，雌雄不拘，體重200～250 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，隨機分為兩組，模型組5只，每日給予0～4℃冰水２ mL灌胃１次，共14 d，灌胃停止后正常飼養。正常對照組5只，每日正常進食飲水飼養，第28天取材。

1.2 取材

動物用戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）行腹膜腔深麻后，開胸經左心室插管至升主動脈，先以150 mL的0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.3）快速沖洗血液，再以500 mL含4%多聚甲醛和0.5%苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.3）灌注固定1.0～1.5 h。灌畢立即取回盲部、距肛門3 cm處的結腸各0.5 cm，并置入含25%蔗糖的0.05mol/L的PBS過夜（4℃），恒冷箱切片。

1.3 免疫組織化學染色

切片經0.05 mol/L PBS（pH7.3）洗3次后，分別進行GAD、GABAA受體、GABAB受體免疫組織化學染色。首先分別用小鼠抗GAD IgG（1：500，Chemicon）、羊抗GABAA受體α3 IgG （1：500，Alamone Labs）、小鼠抗GABAB受體IgG（1：500，Chemicon）抗體在室溫下孵育切片過夜，然后分別將切片移入生物素標記的羊抗小鼠IgG（1：100，Vector）、生物素標記的驢抗羊IgG（1：100，Vector）和生物素標記的羊抗小鼠IgG（1：100，Vector）中孵育4 h，最后移入ABC復合物（1：100，Vector）室溫下孵育4 h。其中一抗和二抗用含5%驢血清、0.05%疊氮鈉、0.5% Triton X-100和0.25%角叉菜膠的0.05 mol/L的PBS稀釋，ABC用含0.3% Triton X-100的0.05 mol/L的PBS稀釋。上述反應完成后的切片進行DAB和H2O2呈色，然后裱片，脫水透明，DPX封片。

1.4 染色結果分析

應用計算機病理圖像分析系統，對切片中各抗體不透光率密度（opacity density， OD）進行半定量分析。OD值代表組織染色強度，即OD值越大，染色越強 。每張切片隨機取兩個視野進行分析，取平均值。

1.5 統計學處理

所有數據以（x±s）表示，采用SPSS 12.0統計學軟件進行多組間比較，采用單因素方差分析，各組間兩兩之間的多重比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

①正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及結腸肌層中GAD主要陽性部位是肌間神經叢，呈較強的棕黃色反應，其中神經纖維染色比神經元胞漿染色更濃，GAD樣陽性神經元胞體約占肌間神經叢神經元的10%左右。IBS模型組回盲部及距肛門3 cm處結腸的GAD免疫反應性均較正常對照組明顯降低（P < 0.05）。②正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及結腸肌層中GABAA受體主要陽性部位是肌間神經叢，呈較強的棕黃色反應，其中大部分為神經纖維染色。IBS模型組回盲部及距肛門3 cm處結腸的GABAA受體免疫反應性均與正常對照組差異無統計學意義（P > 0.05）。③正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及結腸肌層中GABAB受體主要陽性部位是肌間神經叢，呈較強的棕黃色反應，其中大部分為神經纖維染色。IBS模型組回盲部及距肛門3 cm處結腸的GABAB受體免疫反應性均較正常對照組明顯降低（P < 0.05）。見表1。

3 討論

IBS是一種臨床最常見的慢性腸功能紊亂疾病，該病缺乏可解釋癥狀的形態學改變和生化異常，其發病率全球約15%～20%，且多見于女性[1，6]。IBS臨床表現復雜，呈多樣性，常以結腸癥狀為主，也可表現為其他消化道癥狀甚至軀體癥狀。目前IBS的病因尚未完全明了，其涉及因素較多，如腸道運動異常、內臟感覺異常、腦腸相互作用、神經免疫機制等。

ENS由腸道肌間神經叢和黏膜下神經叢組成， 肌間神經叢主要控制胃腸道運動，而黏膜下神經叢主要控制胃腸分泌和局部血流[3，4]。目前發現人腸神經元的總數達到8～10億個，相當于整個脊髓內所含神經元的總數，稱之為腸腦。ENS內含有多種神經遞質，包括經典的神經遞質和腦腸肽等，已經證實的多達數十種。有些遞質與其他遞質共存，有些遞質還以胃腸激素的形式發揮作用，腸神經遞質的多樣性決定了功能的復雜性。目前認為主要的興奮性遞質有乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、P物質、阿片肽和5-羥色胺等[7]，主要的抑制性遞質為一氧化氮（nitric oxide，NO）和血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）等[8]。近年來的研究發現，在IBS患者和動物模型的ENS內，一些神經遞質的含量發生了變化[2～4，9]，提示ENS可能通過這些神經遞質參與了腸道功能失調的發生。

我們既往的研究證實，GABA在ENS內分布的數量要少于Ach、NO和VIP，并且與上述三種神經遞質均有共存（待發表）。在ENS中Ach被認為是主要的興奮性神經遞質，而NO和VIP則為主要的抑制性神經遞質，GABA這種既與興奮性神經遞質共存又與抑制性神經遞質共存的形式提示GABA可能不是直接作用于效應器，而是通過促進或抑制其他遞質而對胃腸動力的興奮和抑制發揮協調作用。本實驗結果表明，大鼠ENS內GABA及其受體主要分布在肌間神經叢，與正常大鼠相比，C-IBS大鼠模型回盲部及距肛門3 cm處結腸肌層中GAD免疫反應性明顯降低（P < 0.05），GABAA受體免疫反應性無明顯變化（P > 0.05），GABAB受體免疫反應性明顯降低（P < 0.05）。GABA在大鼠IBS模型中表達的減少，提示了參與IBS發病的可能。由于GABA主要存在內在神經元中，而且其在胃腸動力過程中發揮間接地協調作用，因而我們推測GABA在協調腸道興奮性和抑制性作用方面發生了失衡，而參與了IBS的發病過程。GABAA受體是配體門控的氯離子通道，而GABAB受體屬于G蛋白偶聯受體，激活后可通過胞內信號轉導系統調制離子通道的活動，二者在ENS中均有表達，說明了GABA調控作用的復雜性。在IBS動物模型中GABAA受體沒有明顯變化，而GABAB受體則表達減少，提示GABA參與IBS發病過程可能主要通過GABAB受體這一途徑實現的。綜合我們的實驗和其他研究[2，10，11]，我們推測在正常腸道中GABA通過不同受體調節不同共存遞質的釋放而在胃腸動力的興奮與抑制中發揮協調作用，在IBS動物模型中，由于GABA及GABAB受體的減少，使GABA在協調腸道興奮性和抑制性作用方面發生失衡，從而參與了IBS的發病過程。對于GABA在IBS發病機制中的具體過程尚需大量的研究工作來證實。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012-05-21）