三磷酸肌醇和PTEN基因表達在槲皮素抑制裸鼠肝癌增長中的作用

彭偉　張繼紅　梁力建

[摘要] 目的 探討三磷酸肌醇（IP3）和PTEN基因表達變化在槲皮素（quercetin）治療裸鼠移植人肝癌中的作用。 方法 以裸鼠移植人肝癌為對照組，槲皮素治療組腹腔注入槲皮素50 mg/（kg·d），對照組腹腔注入含0.04%DMSO的RPMI1640培養基0.05 mL/g，3周后觀察肝癌增長情況，并應用同位素試劑盒檢測肝癌組織IP3含量，RT-PCR分析癌組織PTEN mRNA表達，Western blotting分析肝癌組織PTEN蛋白表達。 結果 治療組肝癌體積和重量均顯著低于對照組[體積（15.8±10.1） mm3 vs （52.3±26.5） mm3，重量（44.8±10.4） mg vs （91.3±31.4） mg]，PTEN mRNA表達顯著高于對照組[RI（灰度與面積之積的相對強度）0.81±0.24 vs 0.36±0.09]（P ＜ 0.01），PTEN蛋白表達顯著高于對照組[RI（灰度與面積之積的相對強度）3.14±0.13 vs 1.08±0.15]。 結論 槲皮素能減少IP3生成，上調肝癌組織PTEN基因表達，抑制裸鼠移植人肝癌增長。

[關鍵詞] 肝細胞癌；染料木黃酮；PTEN基因

[中圖分類號] R735.7[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）21-0008-03

機體應激的變化及基因是否表達的過程都受到細胞信號轉導機制的影響，而且對細胞整體生命機制的表達過程如細胞的增殖、生長、衰老及死亡起到了重要的作用[1]。對于細胞分化、增殖、凋亡的動態穩態及肝癌的產生，關系十分密切[2，3]；惡性腫瘤細胞主要表現為不受控制的生長、凋亡和增殖過程受阻[4]。因此，可通過調節細胞轉導的機制從而達到調控機體基因表達的過程，對于肝癌治療來講，我們可以使得癌細胞進入到凋亡的程序從而達到抑制細胞繁殖的過程。本文研究中是以三磷酸肌醇（IP3）和PTEN基因的表達為對比指標，探討其在槲皮素（quercetin）治療鼠移植人肝癌中具體的表達情況，為磷酸肌醇信號通路抑制劑應用于臨床提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肝癌細胞株（中山大學實驗動物中心細胞庫），胎牛血清（Hyclone），β-肌動蛋白鼠抗（Neomarker），Taq酶（Takara），槲皮素（Sigma），dNTP（上海生工生物工程技術服務有限公司），Tris-EDTA（Sigma），Trizol試劑（MRC），核糖核酸（Ambion），逆轉錄酶（Gibco BRL），胰蛋白酶（Sigma），RPMI1640培養基（Invitrogen），RNase inhibitors（上海生工生物工程技術服務有限公司），IP3檢測試劑盒（Amersham），寡糖D（T）18（上海生工生物工程技術服務有限公司），PVDF膜（羅氏），發光materialanti小鼠（第二抗體）（武漢博士德公司），西班牙低熔點瓊脂糖（Biowest公司）。流式細胞儀（貝克曼-庫爾特公司），PTEN基因單克隆抗體（Santa Cruz），SDS（羅氏），PCR引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的構造取HepG2細胞加入培養液中，培養成分為鏈霉素濃度為100 μg/mL，10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，在5% CO2和95%濕度空氣條件、常溫37℃下進行培養，培養基更換時間為3 d。觀察細胞為培養基85%左右時，進行傳代操作。當傳代達到移植要求時，進行裸鼠模型移植操作。

將HepG2細胞培養液制成5×107/mL的懸液，接種時取0.2 mL懸液注射到4只裸鼠的皮下組織，取體積為1 cm3大小的腫瘤為瘤源模型。待處死動物后，將瘤源完整取下，保持腫瘤的獨立性，去除周圍的組織成分，將生長良好的腫瘤切成直徑在2 mm左右的小塊，放置到生理鹽水中等待使用。取裸鼠27只，發育條件為4～6周，待麻醉操作后沿腹部正中線切開，移植瘤塊到動物肝實質中，然后縫合腹部，模型構造完成。待裸鼠飼養2周后進行觀察研究。

1.2.2 分組操作標準槲皮素500 mg溶于DMSO 2 mL，將RPMI1640培養基配成1 mg/mL槲皮素溶液。注射標準為每克動物0.05 mL，DMSO濃度控制為0.04%。對照組溶劑制備：將2 mL的DMSO加入到培養基中，調配成濃度為0.04%的500 mL備用。飼養14 d后，隨機將動物分為兩組，每組9只動物：槲皮素治療組動物按照50 mg/（kg·d）注入槲皮素；對照組每克動物取0.05 mL，注入培養溶液，待3周后進行后續實驗。

1.2.3 測定腫瘤大小快速對動物進行處死，采取正中切口，肝臟游離后，觀察腫瘤的浸潤類型，對腫瘤就行切除，用電子天平稱重。對腫瘤長短進行測量，取最長單位m和最短單位n，按照公式V=πmn2/6對腫瘤的體積進行計算。取腫瘤小部分制成標本，在-70℃的儀器條件下進行保存。

1.2.4 IP3含量的測定首先制作肝癌組織，保持整體環境低溫，取肝癌組織進行實驗室的離心操作，取上清液調pH值到7.5，再進行離心操作除去KClO4沉淀后，取上清液待測定。

對細胞進行計數后，取樣品加入到100 μL緩沖液、100 μL結合蛋白，100 μL[3H]-IP3稀釋液中，逐步經過離心、干燥處理，取沉淀物與1 mL去離子水進行混合，進行10 min的孵育操作，待操作完成后在液體中加入液閃，混合均勻后進行計數，與標準參考計數值進行對比后即可得到IP3的測定含量。

蛋白濃度的測定：在堿性條件下，加入蛋白后會有紫色沉淀發生，通過562 nm吸收值的測定可得到蛋白的具體濃度，進而得到IP3含量。

1.2.5 PTEN mRNA是否表達的檢測遵照Trizol Reagent法對RNA進行提取操作，完整性檢測以1%的瓊脂凝膠電泳為準。定量RNA后以2 μg為單位進行逆轉錄，再進行PCR操作。上游引物：5-CATTATGACACCGCCAAA-3，下游引物：5-AACGGGGCTACATTATTT-3。循環35次。β-actin上游引物：5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3；下游引物：5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3。循環35次，72℃進行延伸10 min。在凝膠100 V電泳后進行成像觀察，通過半定量分析及面積比，得出相對強度的值，通過比較得出基因的表達規律。

1.2.6 檢測PTEN蛋白PENT蛋白的表達測定參照Western blotting法設定的標準，依次進行電泳、轉膜，封閉操作，在一抗加入后，去除未結合的抗體后加入二抗進行孵育過程，通過計算機進行成像分析及半定量分析處理。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料用（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 分組動物模型的觀察

通過觀察兩分組動物均可見腫瘤繁殖生長的表現。對照組模型動物精神不佳，但體重無增減變化，開腹后腫瘤狀況較好，腹水未發現，無轉移跡象。槲皮素組動物在瘤體的質量和體積測定上均小于對照組，動物檢查未發現腹水及腫瘤轉移跡象。

2.2 移植瘤

通過公式：抑瘤率=（兩組瘤體重量差/對照組瘤體重量）×100%，得到治療組的抑瘤率為50.3%。

2.3 IP3測定值

治療組IP3含量明顯小于對照組含量（P ＜ 0.01）。在重量（t = 3.84）和體積（t = 6.67）的比較上，治療組瘤體均小于對照組（P ＜ 0.01）。見表1。

表1 兩組移植瘤重量、體積及IP3含量的比較（x±s）

2.4 PCR結果處理

見表1、圖1。經圖表分析可得，在PTEN mRNA的表達比較上槲皮素組較對照組增加明顯，經圖像分析結果和半定量測定均得到證實（P ＜ 0.01）。

2.5 Western blotting法分析

見表1、圖2。經圖表分析可得，在PTEN蛋白的表達比較上槲皮素組較對照組增加明顯，經圖像分析結果和半定量測定均得到證實（P ＜ 0.01）。

3 討論

細胞的整體生命過程都受到基因表達的控制。磷酸酶基因編碼的PTEN蛋白可表現為兩種不同的表達類型，其底物主要為PIP3與Akt。因此，在表達的過程上來說PTEN蛋白大都是利用PI3K/Akt通路來控制細胞的生命程序，如周期和凋亡變化[5，6]。當機體內出現惡性腫瘤時，PI3K/Akt通路會出現異常的激活表現，具體體現在激發的反應上，PIP2磷酸化以及PKB/Akt的特殊活化[7]，后者可出現釋放細胞色素C的反應從而使Forkhead家族等轉錄子磷酸化，是細胞的轉錄過程出現問題，從而起到影響細胞凋亡的目的[8，9]。

磷酸肌醇通路信號的特殊變化，在化學反應上不僅表現在對反應有催化作用的PIP和PI兩種激酶活性的增高，而且也可以體現在反應物IP3和二酰基甘油的增高，這對于實驗研究的肝癌細胞的生命過程有著重要的影響[10-12]。筆者通過研究也得到在PI及PIP兩種激酶抑制的情況下槲皮素[13，14]可表現出對肝癌PTEN基因的表達的特殊性調節，進而導致細胞的凋亡。

筆者通過以上研究發現，針對槲皮素對磷酸肌醇信號通路進行抑制的研究，通過裸鼠肝癌模型的建立，發現其可使癌細胞內IP3的含量向減少的方向發展，通過對PTEN基因表達的影響可達到抑制肝癌細胞生長的目的。而且槲皮素可對PI和PIP兩種激酶進行同時抑制[14，15]，說明其可對PTEN基因的表達進行調節，即影響抑制肝癌細胞的生命過程。

本文通過實驗研究表明了肝癌細胞磷酸肌醇通路信號轉導及PTEN基因對肝癌生長的影響，磷酸肌醇信號通路抑制劑方向的研究，是一種新型治療肝癌的方向。

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（收稿日期：2012-05-07）