牛支原體生長曲線的測定和培養基篩選

邵倩 儲岳峰 何生虎 逯忠新

摘要：為篩選最適于牛支原體（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）生長的培養基，利用活菌計數方法測定了牛支原體ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基、牛心湯培養基和改良ＫＭ２培養基中的生長曲線。結果發現，牛支原體在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基中生長３０ ｈ即可達到平臺期，平均最高生長滴度７．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ；在牛心湯培養基中生長４０ ｈ即可達到平臺期，平均最高生長滴度４．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ；在改良ＫＭ２培養基中生長５０ ｈ達到平臺期，其平均最高生長滴度為７．０×１０８ ｃｃｕ／ｍＬ。結果表明，牛支原體在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基中生長快、滴度高，為下一步牛支原體滅活疫苗的研究提供了參考依據。

關鍵詞：牛支原體（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）；培養基篩選；生長曲線

中圖分類號：Ｓ８５２．６２；Ｓ８５８．２３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）03－0549-03

Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ

ＳHAO Ｑｉａｎ１，２，ＣHU Ｙｕｅ－ｆｅｎｇ２，ＨE Ｓｈｅｎｇ－ｈｕ１，ＬU Ｚｈｏｎｇ－ｘｉｎ２

（１. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ； ２. Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒａｚｉｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ， ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ Ｍ． ｂｏｖｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＯＦ２ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ ｍｅｄｉｕｍ， ｔｈｅ ｃａｔｔｌｅ－ｈｅａｒｔ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ ＫＭ２ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ｏｆ Ｍ. ｂｏｖｉｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｒｕｒｅｄ ３０ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ ｍｅｄｉｕｍ， ４０ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔｔｌｅ－ｈｅａｒｔ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ５０ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ ＫＭ２ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＯＦ２ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ７．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ， ４．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ ａｎｄ ７．０×１０８ ｃｃｕ／ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ Ｍ． ｂｏｖｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＯＦ２ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｄｉａ． Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ． ｂｏｖｉｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ； ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ

牛支原體（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）是引起牛的肺炎、關節炎、乳房炎、角膜結膜炎等病的病原體之一［１］。該病原體于１９６１年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離出來［２］，目前在歐洲和北美洲流行并造成了嚴重的經濟損失［３，４］。２００８年，我國部分地區新從外地引進肉牛暴發了由Ｍ．ｂｏｖｉｓ引起的以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，發病率為５０％～１００％，迄今該病原體已在貴州、寧夏、內蒙古、廣西、重慶等省、市、自治區被發現［５－８］。疫苗是有效防制動物傳染病的重要手段之一，但目前我國尚無有關牛支原體疫苗研究的報道。篩選生長快、滴度高的培養基是滅活疫苗生產工藝研究中的一個重要環節。本試驗通過測定牛支原體國內分離株ＯＦ２在不同基礎液配方的支原體培養基中的生長曲線，以期篩選出合適的牛支原體制苗用培養基，為下一步牛支原體滅活疫苗的研究奠定基礎。

１材料和方法

１．１菌株及培養基

牛支原體ＯＦ２株，２０１０年分離自寧夏某地患肺炎犢牛肺組織，參照文獻［５］的方法對其進行特異性ＰＣＲ和１６SＲＮＡ基因測序分析鑒定為牛支原體，本實驗室凍干保存。

改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基，配方為：ＰＰＬＯ肉湯（２１ ｇ／Ｌ）、滅活馬血清（２００ ｍＬ／Ｌ）、２５％酵母浸出液（１００ ｍＬ／Ｌ）、１０％醋酸鉈（１ ｍＬ／Ｌ）、青霉素（０．１ ｇ／Ｌ）、葡萄糖（１ ｇ／Ｌ）、丙酮酸鈉（２ ｇ／Ｌ）、０．４％酚紅（４．５ ｍＬ／Ｌ）。

牛心湯培養基，配方為：１％水解乳蛋白Ｈａｎｋ＇ｓ液（５６２．５ ｍＬ）、牛心湯（３３７．５ ｍＬ）、馬血清（１００ ｍＬ）、２５％酵母浸出液（２０ ｍＬ）、１０％醋酸鉈（１０ ｍＬ）、０．４％酚紅（１．８ ｍＬ）、青霉素（２０萬Ｕ）。

改良ＫＭ２培養基，配方為：ＭＥＭ（５ ｇ）、葡萄糖（０．４ ｇ）、丙酮酸鈉（０．２ ｇ）、水解乳蛋白（５．１ ｇ）、滅活馬血清（２００ ｍＬ）、２５％酵母浸出液（２０ ｍＬ）、１０％醋酸鉈（１ ｍＬ）、０．４％酚紅（１ ｍＬ）、青霉素（２０萬Ｕ）。

以上所配培養基均用１ ｍｏＬ／Ｌ ＮａＯＨ調ｐＨ至７．４～７．８，４ ℃保存備用。

１．２方法

１．２．１培養基適應性試驗?。罚?℃凍存ＯＦ２株菌種３支，分別接種上述３種培養基進行復蘇、傳代，根據培養基顏色變化情況記錄支原體生長情況。

１．２．２生長曲線測定

１）菌液培養。將－７２ ℃凍存的ＯＦ２菌種移入５ ｍＬ的改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ、牛心湯和ＫＭ２培養基中復蘇，復蘇后按體積比１∶２０傳代約３～５代，待生長穩定后擴大培養到５０ ｍＬ，作為待測菌液，置３７ ℃溫箱中培養，從０ ｈ起每隔５ ｈ進行活菌計數。

２）活菌計數與生長曲線繪制。每隔相應的時間從待測菌液取樣，采用活菌梯度稀釋計數法進行計數。具體方法是：將改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ、牛心湯和改良ＫＭ２培養基各分裝于９６孔細胞培養板，每孔２７０ μＬ。第１孔加入待測菌液３０ μＬ，吹打混勻后，?。常?μＬ加入第二孔中，依次重復以上操作至第１０孔，混勻后?。常?μＬ棄去。由此待測菌液被稀釋為１０－１、１０－２、１０－３至１０－１０不同的稀釋度。每種培養基的操作步驟相同，每個時間點分別做３個平行孔，將細胞培養板置于濕盒中３７ ℃恒溫培養，以未接種菌液的培養基為陰性對照，將ｐＨ調至６．８的培養基作為陽性對照。每天觀察接種孔的顏色變化，直至孔顏色不發生變化為止，最后一個變色孔的稀釋度即為待測菌液的生長滴度，用顏色變化單位（Ｃｏｌｏｒ ｃｈａｎｇｅ ｕｎｉｔ，ｃｃｕ）表示。分別用３份樣品的平均滴度（ｘ，ｎ＝３）表示該時間點支原體平均生長滴度。以取樣時間點為橫坐標，平均生長滴度的對數為縱坐標，繪制生長曲線。

２結果

２．１培養基適應性試驗結果

培養試驗結果表明，牛支原體ＯＦ２株在３種培養基中均可生長。記錄傳代穩定后各培養物的顏色變化，結果見表１。從表１可知ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基中生長速度快，１２ ｈ即可觀察到顏色變化，至３０ ｈ已完全變黃；在牛心湯、改良ＫＭ２培養基中分別需１８ ｈ、２４ ｈ肉眼可見生長（顏色變化）。在３６ ｈ時對培養物進行了計數，結果ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基、牛心湯培養基中生長滴度均可達到１０９ ｃｃｕ／ｍＬ，而在改良ＫＭ２培養基中僅為１０７ ｃｃｕ／ｍＬ。

２．２生長曲線的測定結果

牛支原體ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基、牛心湯培養基和改良ＫＭ２培養基中的生長滴度變化見表２，并據此繪制了生長曲線圖（圖１）。從表２和圖１中可以看出，牛支原體ＯＦ２菌株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基中平均生長滴度最高可至７．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ，在３０ ｈ左右到達平臺期，３０～５０ ｈ之間滴度可維持在１０９ ｃｃｕ／ｍＬ數量級。牛支原體ＯＦ２菌株在牛心湯培養基中最高生長滴度可至４．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ，在４０ ｈ左右進入平臺期，４０～５５ ｈ之間滴度可維持在１０９ ｃｃｕ／ｍＬ數量級。牛支原體ＯＦ２菌株在改良ＫＭ２培養基中生長相對緩慢，在５０ ｈ左右進入平臺期，平均生長滴度最高為７．０×１０８ ｃｃｕ／ｍＬ。

３討論

由于支原體基因組小，自身合成能力較弱，體外培養時所需營養要求高，培養條件較為嚴格［９］，因此篩選成本較低且利于牛支原體生長的培養基對牛支原體滅活疫苗的研究具有重要的意義。常見的支原體培養基常在３種不同的基礎液配方上進行改良而來：ＰＰＬＯ，如Ｅａｔｏｎｓ、Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基等；牛心湯，如Ｈａｙｆｉｌｃｋｓ、Ａ６２培養基和本試驗所用的牛心湯培養基等；富含氨基酸和維生素的人工基礎液，如Ｆｒｅｙｓ、改良Ｆｒｅｙｓ培養基和改良ＫＭ２培養基等。本實驗室此前曾對絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體等支原體最適培養基進行了篩選，發現不同的支原體其最適培養基并不一致［１０］。因此有必要觀察牛支原體在這３種不同基礎液配方的培養基上的適應情況和生長表現。結果表明，牛支原體在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基中生長快、滴度高，適合于滅活疫苗生產過程中菌體的培養。當然，就所測得的生長曲線而言，本試驗結果僅是實驗室階段小量培養得到的數據，在進行中試規?；蛏a規模的牛支原體培養或發酵罐生產時可作為參考依據，但擴大規模后尚需要進一步進行有關工藝條件的研究。

另外，從培養基材料來源和成本分析，ＫＭ２培養基和Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基中的材料均為商業化試劑，來源方便且質量可控；而牛心湯培養基中的牛心湯目前國內尚未見商品，常由實驗室從屠宰場購置后自行制造，除了有生物材料污染的風險以外，沒有相關質量標準也不符合當前農業部發布的有關獸用疫苗研制指導原則。因此，從這兩方面看，改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培養基應作為牛支原體滅活疫苗研制的首選培養基。

參考文獻：

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［９］ 畢丁仁， 王桂枝． 動物霉形體及研究方法［Ｍ］．北京：中國農業出版社，１９９８．１２２－１３８．

［１０］ 趙萍，儲岳峰，高鵬程，等． 絲狀支原體山羊亞種最佳培養基的篩選［Ｊ］． 動物醫學進展，２００８（１）：２１－２３．

（責任編輯曾德芳）

收稿日期：２０１１－０７－１１

基金項目：甘肅省農業生物技術專項（ＧＮＳＷ－２０１０－０９）；甘肅省科技支撐計劃項目（１０１１ＮＫＣＡ０５４）；國家科技基礎性工作專項計劃

（２００８ＦＹ２１０２００）

作者簡介：邵倩（１９８５－），女，寧夏固原人，在讀碩士研究生，主要從事畜禽疾病防控技術基礎研究，（電話）１３９９５４９５６０３（電子信箱）

Ｓｈａｏｑｉａｎ＿０８１８＠１２６．ｃｏｍ；通訊作者，何生虎，（電子信箱） ｈｅｓｈｅｎｇｈｕ３０８＠１６３．ｃｏｍ；逯忠新，（電子信箱）ｌｕｚｈｏｎｇｘｉｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。