高效液相色譜-熒光檢測畜禽糞污中四種氟喹諾酮類抗生素殘留

張敏 劉慶玉 敖永華

摘要：為了建立高效液相色譜－熒光測定畜禽糞污中氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星殘留的分析方法，將畜禽糞便樣品經乙腈超聲提取，再經正己烷液－液萃取，并經氮吹濃縮，乙腈與水混合溶解殘渣，過微孔濾膜，采用高效液相色譜－熒光檢測，以０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺（ｐＨ ３．０）／乙腈（９４／６，Ｖ／Ｖ）為流動相，于激發波長２８０ ｎｍ、發射波長４８０ ｎｍ處進行檢測。結果表明，畜禽糞污樣品中４種喹諾酮類抗生素的平均回收率為７７．８％～９８．２％，相對標準偏差為３．５％～７．２％，檢測限為０．００５～０．０１0 μｇ／ｋｇ。該方法簡便、快速，可滿足畜禽糞污中4種喹諾酮類獸藥殘留量的同時檢測。

關鍵詞：畜禽糞污；喹諾酮類抗生素；高效液相色譜法；熒光檢測

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）03－0602-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Kinds of Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ Ｆｅｃｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＺＨＡＮＧ Ｍｉｎ，ＬＩＵ Ｑｉｎｇ－ｙｕ，ＡＯ Ｙｏｎｇ－ｈｕａ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ ｆｅｃｅｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｄｏｕｂｌｅ ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎ－ｈｅｘａｎｅ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ ｖａｐｏｒｉｚｅｄ ｂｙ nitrogen stream， ｆｏｕｒ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ high performance liquid chromatography-ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ２８０ ｎｍ ａｎｄ ４８０ ｎｍ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｕｓｉｎｇ ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ｐＨ ３．０）／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ （９４／６，Ｖ／Ｖ） ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ ｆｅｃｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ７７．８％ ｔｏ ９８．２％， and ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ were ３．５％～７．２％． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ ０．００５ ｔｏ ０．０１0 μｇ／ｋｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｕｌｔｉｒｅｓｉｄｕｅｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅａｓｙ ａｎｄ ｆａｓｔ． Ｉｔ ｈａｓ ａｌｓｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ four kinds of ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｆｅｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｆｅｃｅｓ； ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ； ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔ

近年來，隨著集約化畜牧業以及配合飼料工業的發展，抗生素作為飼料添加劑等越來越被廣泛地應用于畜禽養殖業中。獸用藥物在保障動物健康、提高畜禽生產力和改善人民生活水平等方面都起著重要的作用，獸用藥物的種類及用量與日俱增，盡管抗生素作為獸藥和飼料添加劑在畜禽疾病防治和生長促進方面發揮了較大的作用，然而，抗生素通過口服或肌肉注射進入動物體內后，僅少量被內臟器官吸收利用，約３０％～９０％以原藥和代謝產物的形式經動物的糞便和尿液進入生態環境中，給環境土壤、表層水體等生態環境帶來不良影響［１］。目前，畜禽養殖糞便及其施肥土壤中的獸用抗生素污染已經達到較為嚴重的程度，畜禽糞便中抗生素帶來的環境污染問題引起了各方面的關注和重視［２］。

喹諾酮類藥物是最近２０年來迅速發展起來的一類十分重要的廣譜抗生素，是繼磺胺類藥物之后人類在合成抗生素方面最重要的突破，其抗菌作用是磺胺類藥物的近千倍。氟喹諾酮（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ，ＦＱｓ）類藥物是第三代喹諾酮類藥物，廣泛地用于畜禽的細菌、霉形體病防治，已投入使用或即將進人獸醫領域的藥物有１０多種，目前國內外已批準用于動物的ＦＱｓ包括恩諾沙星（Ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＥＮＲ）、諾氟沙星（Ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ，ＮＯＲ）、環丙沙星（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＣＩＰ）、氧氟沙星（Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＯＦＬ）等［３］。

近年來，氟喹諾酮類抗生素已在水環境、土壤環境和畜禽廢物中有不同程度的檢出［４－８］。對水環境、土壤、肉、奶、蛋等中氟喹諾酮類抗生素殘留檢測技術的研究較多，主要是采用液相色譜－質譜聯用方法，但利用高效液相色譜儀分析畜禽糞便中氟喹諾酮類抗生素的報道很少。為此，本研究建立了高效液相色譜－熒光檢測同時測定土壤中４種氟喹諾酮類抗生素的分析方法，旨為畜禽糞便中抗生素獸藥殘留提供技術支持。

１材料與方法

１．１儀器與試劑

Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色譜儀（配熒光檢測器），Ｍｉｌｌｉｏｎ－Ｑ超純水制備系統，超聲波清洗器，旋渦混合器，離心機，精密ｐＨ計，氮吹儀等。

４種氟喹諾酮類抗生素標準品：氧氟沙星（ＯＦＬ）、諾氟沙星（ＮＯＲ）、環丙沙星（ＣＩＰ）和恩諾沙星（ＥＮＲ），純度＞９９．０％，Ｓｉｇｍａ公司。甲醇和乙腈，色譜純，Ｆｉｓｈｅｒ公司；其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

１．２試驗方法

１．２．１糞尿樣品的前處理

1）畜禽糞便：準確稱取待測雞或豬糞便１０.00 ｇ，置于５０ ｍＬ離心管中，加２０ ｍＬ乙腈和２ ｇ無水硫酸鈉浸泡提取，在漩渦混勻器上以２ ５００ ｒ／ｍｉｎ混勻１ ｍｉｎ，４５ ℃超聲２５ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，將上清液轉入濃縮瓶中，再重復提取兩次，合并上清液，樣品上層清液用４０ ｍＬ正己烷萃取兩次，氮氣吹至近干，用２ ｍＬ乙腈飽和的正己烷溶解殘余物，轉入１０ ｍＬ離心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去正己烷層，下層清液用尼龍微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測定。

2）畜禽尿液及養殖廢水：取畜禽尿液及養殖廢水３０ ｍＬ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，將上層清液用４０ ｍＬ正己烷萃取兩次，氮氣吹至近干，用２ ｍＬ乙腈飽和的正己烷溶解殘余物，轉入１０ ｍＬ離心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去正己烷層，下層清液用尼龍微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測定。

１．２．２色譜條件Ｗａｔｅｒｓ色譜柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；激發波長為２８０ ｎｍ，發射波長為４８０ ｎｍ；柱溫為４０ ℃；進樣量為１０ μＬ；流動相為０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺（ｐＨ３．０）／乙腈（９４／６，Ｖ／Ｖ）；流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．２．３標準曲線分別精確稱取０．０１０ ０ ｇ氟喹諾酮類抗生素于１００ ｍＬ容量瓶中，再加入１０ ｍＬ ０．０３ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉進行溶解，用乙腈定容至刻度，搖勻，得１００ μｇ／ｍＬ的標準儲備液。將標準儲備液逐級稀釋，依次得０．０１、０．０２、０．０５、０．１０、０．２０、０．５０、１．００ μｇ／ｍＬ的標準品工作液，以色譜峰面積對質量濃度作圖，得出氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星四種氟喹諾酮類抗生素獸藥的標準曲線。

２結果與分析

２．１色譜條件的選擇

２．１．１流動相的選擇氟喹諾酮類藥物屬兩性化合物，具有兩性官能基團，在水溶液中均以離子形式存在，在流動相中加入離子對試劑可以降低其極性以改善峰形和提高分離度。研究過程中分別以不同離子對試劑為流動相考察對氟喹諾酮分離的影響。試驗確定了０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺與乙腈（９４／６， Ｖ／Ｖ）溶液為流動相，可獲得４種喹諾酮類抗生素標準溶液的色譜分離圖（圖１），２5 ｍｉｎ內均能達到基線分離。

２．１．２檢測波長的確定氟喹諾酮類藥物含苯環結構和共軛大π鍵，因此有較高的熒光效率，可采用熒光檢測器進行定量分析。采用熒光檢測比紫外檢測高１～２個數量級。對４種氟喹諾酮類藥物分別進行激發－發射波長掃描，結合其最大吸收波長，實驗確定了激發波長為２８０ ｎｍ和發射波長為４８０ ｎｍ為熒光檢測條件。

２．２線性關系和檢出限

在選定的色譜條件下，取不同濃度的４種氟喹諾酮標準混合溶液分別進樣，以峰面積對進樣量進行線性回歸，４種氟喹諾酮類藥物在０．０1～１．００ μｇ／ｍＬ范圍內，濃度和峰面積呈現良好的線性關系，可以滿足定量分析的需要，其線性范圍見表１。以信噪比（Ｓ／Ｎ）為３計算方法的檢出限（ＬＯＤ），對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的檢測限分別為：０．０１0、０．００５、０．０１0和０．０１0 μｇ／kg。

２．３回收率和精密度

配制不同濃度的混合標樣，分別對畜禽糞污樣品和空白樣品進行添加回收實驗。４種氟喹諾酮類藥物的添加回收率均在７７．８％～９８．２％之間，其多次測定的相對標準偏差在３．５％～７．２％之間，該方法穩定性和重現性均較好，能滿足畜禽糞便中氟喹諾酮類藥物殘留檢測。回收率和方法的相對標準偏差見表２，空白譜圖和添加濃度０．０1 ｍｇ／ｋｇ的色譜圖見圖２和圖３。

３結論

運用所建立的方法對４種氟喹諾酮類藥物在各基質中進行檢測，平均回收率在７７．８％～９８．２％之間， 檢測限為０．００５～０．０１0 μｇ／ｋｇ，測定的相對標準偏差在３．５％～７．２％之間，且各藥物濃度和峰面積呈現良好的線性關系，表明方法的準確性、精密度和靈敏度均符合殘留分析要求。所建立的方法操作簡便、靈敏度高，適用于畜禽糞污中４種氟喹諾酮類藥物殘留的同時測定。

參考文獻：

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（責任編輯胡西洲）

收稿日期：２０１１－０８－０１

基金項目：沈陽市科學計劃項目（Ｆ１０－２３２－４－００）

作者簡介：張敏（１９７８－），女，遼寧朝陽人，講師，博士，主要從事農業污染治理和資源化利用教學和科研工作，（電話）１３６１４０２０８０６（電子信箱）

ｍｉｎｚｈａｎｇ４１２＠１６３．ｃｏｍ；通訊作者，劉慶玉，教授，博士生導師，主要從事農業生物環境與能源利用教學和科研工作，

（電子信箱）ｑｙｌｉｕ＠１２６．ｃｏｍ。