二氧化氯對氣單胞菌的抑菌和殺菌效果研究

譚鳳霞 吳全超

摘要：以嗜水氣單胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）標準菌株ＡＴＣＣ７９６６和分離自養殖水環境及患病鯽魚的氣單胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）為試驗菌株，通過肉湯二倍稀釋法研究二氧化氯的抑菌及殺菌效果。結果表明，二氧化氯在低濃度時能抑制氣單胞菌的生長增殖，高濃度時能殺滅細菌，其對ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６菌株的最小抑菌濃度（ＭＩＣ）為１２ ｍｇ／Ｌ，對Ｔ２菌株的最小抑菌濃度為２４ ｍｇ／Ｌ；二氧化氯對ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株的最小殺菌濃度（ＭＢＣ）為９６ ｍｇ／Ｌ，對Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株的最小殺菌濃度為３８４ ｍｇ／Ｌ。研究結果能為二氧化氯在水產養殖上的合理使用提供一定的依據。

關鍵詞：二氧化氯；氣單胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

中圖分類號：Ｓ859.79+9.1文獻標識碼：Ａ文章編號：０４３９－８１１４（２０１２）０３－０５67－０4

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Bａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ａｎｄ Bａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ Ｅｆｆect ｏｆ Ｃｈｌｏｒｉｎｅ Ｄｉｏｘｉｄｅ ｏｎ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ

ＴＡＮ Ｆｅｎｇ－ｘｉａ，ＷＵ Ｑｕａｎ－ｃｈａｏ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｔｅｒ ｏｒ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｆｉｓｈ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｏｘｉｄｅ ｔｏ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｏｘｉｄｅ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｋｉｌｌｅｄ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ） ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｏｘｉｄｅ ｔｏ ｓｅｖｅｎ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｅ １２ ｍｇ／Ｌ ｔｏ ｓｔｒｉａｎｓ ＡＴＣＣ７９６６， Ｔ１， Ｔ３， Ｔ４， Ｔ５ ａｎｄ Ｔ６， ａｎｄ ２４ ｍｇ／Ｌ ｔｏ ｓｔｒａｉｎ Ｔ２； Tｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＢＣ） ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｏｘｉｄｅ ｔｏ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ａｒｅ ９６ ｍｇ／Ｌ ｔｏ ｓｔｒｉａｎｓ ＡＴＣＣ７９６６， Ｔ１， Ｔ３ ａｎｄ Ｔ４， ａｎｄ ３８４ ｍｇ／Ｌ ｔｏ ｓｔｒａｉｎｓ Ｔ２， Ｔ５ ａｎｄ Ｔ６． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｏｘｉｄｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｏｘｉｄｅ； Ａｅｒｏｍｏｎａｓ； ＭＩＣ； ＭＢＣ

氣單胞菌屬（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）廣泛分布于自然界，其中嗜水氣單胞菌（Ａ. ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、豚鼠氣單胞菌（Ａ. ｃａｖｉａｅ）及溫和氣單胞菌（Ａ. ｓｏｂｒｉａ）等已被確認是多種水產動物重要的病原菌，常給養殖生產帶來較大的經濟損失［１］。二氧化氯作為水產養殖上常用的消毒劑，不僅能大幅度減少養殖水體中致病微生物的數量，而且不損害浮游生物，對水體具有消毒、增氧作用［２］，對魚類的出血性敗血病、爛鰓病、赤皮病、腸炎、水霉病和對蝦的弧菌病、病毒病等均有顯著療效。經農業部新漁藥臨床試驗檢測認定，穩定性二氧化氯無刺激性、不損傷水生生物，能改善水質，與其他對照藥物相比，具有殺菌時間短、副作用小等優點，可用于水產品育苗［３－１０］。本研究以嗜水氣單胞菌標準菌株ＡＴＣＣ７９６６、分離自患病鯽魚和養殖水環境中的氣單胞菌作為試驗菌株，研究二氧化氯對氣單胞菌的抑菌及殺菌效果，為二氧化氯在水產養殖上的合理使用提供依據。

１材料與方法

１．１材料

二氧化氯制劑（購自四川華強漁牧藥業有限公司，規格１００ ｇ／袋，含８．０ ｇ亞氯酸鈉）；培養基為牛肉膏液體和固體培養基，ｐＨ （７．０±０．２），中和劑（５ ｇ／Ｌ硫代硫酸鈉和５ ｇ／Ｌ吐溫－８０）；試驗所用其他試劑均為分析純。

供試菌株嗜水氣單胞菌標準菌株ＡＴＣＣ７９６６購自中國農業微生物保藏中心；氣單胞菌Ｔ１和Ｔ２菌株分離自患病鯽魚；氣單胞菌Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５和Ｔ６菌株均分離自養殖水環境。

１．２方法

１．２．１菌懸液的制備將各供試菌株純培養物用單倍營養肉湯培養，經增菌搖床過夜培養，取２４ ｈ新鮮培養物加甘油置于－８０ ℃冰箱中保存備用，試驗前1 d取出接種于營養瓊脂斜面，２８ ℃恒溫培養２４ ｈ后取出，用胰蛋白胨生理鹽水溶液（ＴＰＳ）洗下菌苔，制成菌懸液，分別取各菌懸液與有機干擾物（３％牛血清白蛋白）以１∶１的體積比混合制備成試驗菌懸液，備用。

１．２．２二氧化氯對氣單胞菌最小抑菌濃度（ＭＩＣ）的測定用蒸餾水將二氧化氯制劑稀釋成８個濃度梯度的受試液，折合二氧化氯含量分別為３、６、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４ ｍｇ／Ｌ；依次取各稀釋度受試液２．５ ｍＬ加入到含２．５ ｍＬ雙倍濃度營養肉湯的試管中，然后接種０．１ ｍＬ含菌量約為１０８ ＣＦＵ／ｍＬ的菌懸液，作為試驗組。以同樣方法接種各供試菌株菌懸液于不含二氧化氯制劑的營養肉湯中，作為陽性對照組。陰性對照組只含營養肉湯，不接種細菌。２８ ℃恒溫培養２４ ｈ，觀察結果。通過觀察細菌的生長情況，確定二氧化氯對氣單胞菌的ＭＩＣ。

當陽性對照組有細菌生長（渾濁），陰性對照組無菌生長（透明），試驗組中無菌生長的最低二氧化氯濃度即為二氧化氯對該供試菌株的ＭＩＣ。

１．２．３二氧化氯對氣單胞菌最小殺菌濃度（ＭＢＣ）的測定在ＭＩＣ測定試驗的基礎上進行ＭＢＣ的測定，ＭＩＣ測定試驗培養２４ ｈ后，觀察結果，分別吸取試驗組中無菌生長的抗（抑）菌劑０．５ ｍＬ于含４．５ ｍＬ中和劑溶液的試管中，混勻，作用10 ｍｉｎ；吸取中和后的樣液２．５ ｍＬ加入到含２．５ ｍＬ雙倍濃度營養肉湯的試管中。同時設陽性對照組、陰性對照組、中和劑對照組。２８ ℃恒溫培養２４ ｈ，觀察結果。

當陽性對照組有細菌生長（渾濁），陰性對照組無菌生長（透明），中和劑對照組無菌生長（透明），試驗組中無菌生長的最低二氧化氯濃度即二氧化氯對該供試菌株的ＭＢＣ。

２結果與分析

２．１二氧化氯對氣單胞菌的抑菌作用

各菌株在含有不同濃度的二氧化氯的營養肉湯中培養２４ ｈ后觀察二氧化氯對各氣單胞菌菌株的抑菌作用，結果見表１。由表１可知，陽性對照組試管均渾濁，表示７種供試菌株在２４ ｈ內均能存活或增殖，陰性對照組各試管均透明，表示培養液無菌。試驗組各試管在不同濃度下表現為透明或渾濁現象，其中二氧化氯濃度在６ ｍｇ／Ｌ及以下濃度時，試驗組各試管 （Ｔ２菌株除外）均表現為渾濁現象，表示二氧化氯在該濃度下不能抑制細菌的生長，而二氧化氯濃度在１２ ｍｇ／Ｌ及以上濃度時，各試管（Ｔ２菌株除外）均表現為透明現象，表示在該濃度下細菌的生長被抑制；Ｔ２菌株組在二氧化氯濃度為１２ ｍｇ／Ｌ及以下濃度時表現為渾濁現象，在２４ ｍｇ／Ｌ及以上濃度時，二氧化氯能抑制Ｔ２菌株的生長。

２．２二氧化氯對氣單胞菌的殺菌作用

在二氧化氯抑菌試驗的基礎上，加入中和劑中和二氧化氯制劑的殘留作用，在營養肉湯中繼續培養２４ ｈ后觀察二氧化氯對各氣單胞菌菌株的殺菌作用，結果見表２。由表２可知，陽性對照組各試管均渾濁，表明７種供試菌株在２４ ｈ內均能存活或增殖；陰性對照組各試管均透明，表明培養液無菌生長；中和劑對照組各試管均透明，表明中和劑無菌。試驗組各試管在不同濃度下表現為透明或渾濁現象，其中ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株在二氧化氯濃度為４８ ｍｇ／Ｌ及以下濃度時，而Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株則在二氧化氯濃度為１９２ ｍｇ／Ｌ及以下濃度時，試驗組各試管表現出渾濁現象，表明該濃度下的二氧化氯只是抑制了細菌的生長，不能殺滅細菌，在二氧化氯的殘留作用被中和劑中和后，細菌重新開始生長增殖；而ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株在二氧化氯濃度為９６ ｍｇ／Ｌ及以上濃度時，Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株則在二氧化氯濃度為３８４ ｍｇ／Ｌ及以上濃度時，試驗組各試管均表現為透明現象，即在二氧化氯的殘留作用被中和劑中和后，培養液中無細菌生長繁殖，表明在該濃度下細菌已被殺滅。

２．３二氧化氯對氣單胞菌的ＭＩＣ和ＭＢＣ

根據二氧化氯對氣單胞菌的ＭＩＣ及ＭＢＣ的評判方法，抑菌試驗中無菌生長的最低二氧化氯濃度即為二氧化氯對該供試菌株的ＭＩＣ，殺菌試驗中無菌生長的最低二氧化氯濃度即為二氧化氯對該供試菌株的ＭＢＣ。二氧化氯對７種供試菌株的ＭＩＣ和ＭＢＣ見表３。在本試驗所設定的濃度梯度下，二氧化氯對各氣單胞菌菌株的ＭＩＣ為１２ ｍｇ／Ｌ（對Ｔ２菌株的ＭＩＣ為２４ ｍｇ／Ｌ）；而二氧化氯對各氣單胞菌菌株的ＭＢＣ有所不同，其中對ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株的ＭＢＣ為９６ ｍｇ／Ｌ，但對Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株的ＭＢＣ為３８４ ｍｇ／Ｌ。

３討論

氣單胞菌廣泛存在于養殖水環境中，是重要的水生動物病原菌之一。二氧化氯是水產養殖上常用的消毒劑之一，目前應用于池塘水體消毒的二氧化氯有一元二氧化氯和二元二氧化氯兩種。二元二氧化氯對水生動物致病菌的抑菌及殺菌效果的研究已展開，江為民等［３］測定了二氧化氯對１０種甲魚致病菌在營養肉湯中的ＭＩＣ和在池塘水體中的ＭＢＣ，結果表明，二氧化氯在營養肉湯中對病原菌有一定的抑菌作用，對其中６種致病菌的ＭＩＣ小于２５ μｇ／ｍＬ；二氧化氯對池塘水體的殺菌效果較理想，對其中７種致病菌的ＭＢＣ小于６．２５ μｇ／ｍＬ，以作用３０ ｍｉｎ殺菌效果最佳，認為二氧化氯在甲魚病害防治上是一種較有前途的藥物。艾曉輝等［４］在１３～１５ ℃條件下，測定了二氧化氯制劑（亞氯酸鹽與酸性活化劑質量比１∶１）對嗜水氣單胞菌９１２０和Ｔ３菌株、魚害粘球菌（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｐｉｓｃｉｃｏｌａ）Ｇ４菌株、腸型點狀產氣單胞菌（Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ ｆ． ｉｎｔｅｒｔｉｎａｌｉs）５８－２０－９菌株、熒光極毛桿菌（Ｐseudomonas ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５６－１２－１０菌株、點狀產氣單胞菌點狀亞種（Ａ． ｐｕｎｃｔａｔａ ｓｕｂ． ｐｕｎｃｔａｔａ）ＳＴ７８－３－３菌株、鰻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）Ｅ３－１１菌株等７種水產養殖動物致病菌作用３０ ｍｉｎ的ＭＢＣ分別為３．１２、３．１２、１．５６、１２．５０、２５．００、６．２５、１２．５０ μｇ／ｍＬ。陳超然等［５］測定了二氧化氯對柱狀嗜纖維菌（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）ＧＣＲ－９０６１菌株和ＳＣ－２菌株的ＭＢＣ分別為１．５６ ｍｇ／Ｌ和０．７８ ｍｇ／Ｌ；對嗜水氣單胞菌ＢＳ－６菌株和ＺＨＢ－７菌株的ＭＢＣ分別為１．５６ ｍｇ／Ｌ和０．７８ ｍｇ／Ｌ；對鰻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）Ｊ－Ｏ－１菌株和Ｋ－３菌株的ＭＢＣ分別為３．１３ ｍｇ／Ｌ和１．５６ ｍｇ／Ｌ；對遲鈍愛德華氏菌（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ，Ｅｔ）ＥＦ－１菌株和ＥＴ－１２菌株的ＭＢＣ均為１．５６ ｍｇ／Ｌ。劉小燕等［６］測定了二氧化氯對腸型點狀氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、柱狀曲橈桿菌（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）的ＭＩＣ分別為０．１７、０．１７、０．０６ μｇ／ｍＬ，ＭＢＣ分別為０．２３、０．２３、０．１７ μｇ／ｍＬ。而本試驗所用二氧化氯為一元二氧化氯，其規格為１００ ｇ二氧化氯制劑中含有效成分亞氯酸鈉８.0 ｇ，在試驗設定的濃度梯度下，二氧化氯對各氣單胞菌菌株的ＭＩＣ為１２ ｍｇ／Ｌ（對Ｔ２菌株的ＭＩＣ為２４ ｍｇ／Ｌ），而二氧化氯對各氣單胞菌菌株的ＭＢＣ有所不同，其中對ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株的ＭＢＣ為９６ ｍｇ／Ｌ，但對Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株的ＭＢＣ為３８４ ｍｇ／Ｌ；但是，由于試驗觀察到從渾濁變為透明的濃度范圍較大，如Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株MBC的范圍為１９２～３８４ ｍｇ／Ｌ，所以二氧化氯對７種供試菌株的ＭＩＣ或ＭＢＣ實際值可能要低于本試驗確定的數值。一元二氧化氯配制方法簡單，使用相對比較安全，但受含量的限制（不得高于１０％），其施用效果往往不盡如人意。二元二氧化氯含量高，為Ａ、Ｂ兩種分裝，Ａ主要成分為亞氯酸鈉和穩定劑碳酸鈉，Ｂ的主要成分為活化劑檸檬酸等。

本試驗分別采用嗜水氣單胞菌的標準菌株ATCC7966、分離自患病鯽魚以及養殖水環境中的氣單胞菌為試驗菌株，研究二氧化氯作為水產養殖上常用消毒劑的抑菌及殺菌效果，這一結果可為二氧化氯的合理使用提供一定的依據。

參考文獻：

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收稿日期：２０１１－０７－２０

基金項目：長江大學博士啟動基金項目（８０１２０００１０１１０）

作者簡介：譚鳳霞（１９７９－），女，山東濰坊人，講師，博士，主要從事微生物學方面的研究工作，（電話）１３２２７６４０３５６（電子信箱）

ｔａｎｆｅｎｇｘｉａ２００８＠１６３．ｃｏｍ。