拮抗香蕉枯萎病菌的海洋細(xì)菌TC-1發(fā)酵條件優(yōu)化

易潤(rùn)華 張雅娟 岳蕾娜 黃華鋒 齊希猛

摘要：通過(guò)對(duì)６種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選得到海洋拮抗細(xì)菌ＴＣ－１在ＢＰＤＢ培養(yǎng)基發(fā)酵的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ）的抑菌活性最好。在ＢＰＤＢ培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分及用量，得到最佳配方為馬鈴薯２００ ｇ，牛肉膏２０ ｇ，葡萄糖２０ ｇ，玉米粉７ ｇ、蛋白胨７ ｇ，蒸餾水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ自然；通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件的裝瓶量、培養(yǎng)溫度、初始ｐＨ、發(fā)酵時(shí)間和轉(zhuǎn)速５個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：裝瓶量２０％，培養(yǎng)溫度２７℃，初始ｐＨ自然，發(fā)酵時(shí)間７２ ｈ，搖床轉(zhuǎn)速２００ ｒ／ｍｉｎ；在最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件下，ＴＣ－１的無(wú)菌發(fā)酵液抑菌圈直徑為２４．３ ｍｍ，與優(yōu)化前抑菌圈直徑２０．７ ｍｍ相比，抑菌活性提高了１７．４％。

關(guān)鍵詞：海洋細(xì)菌；抑菌活性；香蕉枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． cｕｂｅｎｓｅ）；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Ｓ４３６．６８＋１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）03－0506-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒａｉｎ ＴＣ－１ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ Ｒａｃｅ ４ Ｃａｕｓｉｎｇ Ｂａｎａｎａ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｗｉｌｔ

ＹＩ Ｒｕｎ－ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ Ｙａ－ｊｕａｎ，ＹＵＥ Ｌｅｉ－ｎａ，ＨＵＡＮＧ Ｈｕａ－ｆｅｎｇ，ＱＩ Ｘｉ－ｍｅｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Bｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０８８， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ （ＣＦＬ） ｆｒｏｍ ｓｉｘ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉa ａｆｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＴＣ－１ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｆｏｒ ４８ ｈ ｗｅｒｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｏｘｆｏｒｄ ｃｕｐ ｍｅｔｈｏｄ. Tｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｈａｌｏｓ ｏｆ ＣＦＬ ｆｒｏｍ ＢＰＤＢ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ the ｂｉｇｇｅｓｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｓｉｘ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉa． Ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｏｆ ＣＦＬ， ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ｄｏｓａｇｅｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ be added ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎａｌ ＢＰＤＢ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ by ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. Tｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｐｏｔａｔｏ ２００ ｇ， bｅｅｆ eｘｔｒａｃｔ ２０ ｇ， Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ ｇ，ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ７ ｇ ａｎｄ ｐｅｐｔｏｎｅ ７ ｇ ｉｎ １ ０００ ｍL ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ． Ｔｈｅ Ｌ２５（５６） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｍｅｄｉｕｍ ｑｕａｎｔｉｔｙ ２０％，ｃｕｌｔｉｖａｔing ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２７ ℃， ｉｎｉｔｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐＨ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ５ ｍｍ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ９６ ｈ， ｒｏｔａｔion ｓｐｅｅｄ １２０ ｒ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｈａｌｏｓ ｏｆ ＣＦＬ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍum ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ was ２４．３ ｍｍ； ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ was ｉｎｃｒｅａｓｅｄ by １７．４％， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ２０．７ ｍｍ ｂｅｆｏｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍａｒｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ； antifungal activity； ｂａｎａｎａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｗｉｌｔ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

香蕉枯萎病是一種對(duì)香蕉具有毀滅性的病害，是國(guó)內(nèi)外檢疫對(duì)象，該病是由尖孢鐮刀菌［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ（Ｅ． Ｆ． Ｓｍｉｔｈ） Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ Ｈａｎｓｅｎ（ａｎａｍｏｒｐｈ）］引起的，該病菌有４個(gè)生理小種，在我國(guó)有１號(hào)和４號(hào)小種，其中以４號(hào)小種的危害性最大［１－５］。本研究對(duì)從廣東湛江特呈島近海岸海泥中分離得到的一株對(duì)香蕉枯萎病菌４號(hào)小種有穩(wěn)定拮抗作用的海洋細(xì)菌ＴＣ－１的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為該菌株作為香蕉枯萎病的生防菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１菌株來(lái)源

拮抗海洋細(xì)菌菌株ＴＣ－１為２００５年從廣東省湛江市特呈島近海海泥中分離篩選得到的對(duì)香蕉枯萎病菌及其他１４種病原微生物有很好拮抗作用的海洋細(xì)菌，初步鑒定為芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）［６］。香蕉枯萎病菌４號(hào)生理小種是從發(fā)病植物組織中分離得到。

１．２無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性測(cè)定

１）無(wú)菌發(fā)酵液制備：將海洋細(xì)菌ＴＣ－１菌種在ＢＰＤＡ培養(yǎng)基（馬鈴薯２００ ｇ，牛肉膏２０ ｇ，葡萄糖２０ ｇ，瓊脂１５～１８ ｇ，蒸餾水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ自然）平板上劃線，培養(yǎng)４８ ｈ后，挑?。裕茫庇脽o(wú)菌水稀釋得到１０６～１０７ ＣＦＵ／ｍＬ的菌液。取菌液按１％接種量接種到各發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)發(fā)酵，菌液經(jīng)８ ０００ ｒ／ｍｉｎ兩次離心３０ ｍｉｎ除去菌體，上清液經(jīng)孔徑為０．２２ μｍ的濾膜過(guò)濾除菌后得到無(wú)菌發(fā)酵液，４ ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

２）抑菌活性測(cè)定：在ＰＤＡ培養(yǎng)基上將香蕉枯萎病菌４號(hào)小種培養(yǎng)５～７ ｄ，用無(wú)菌水將孢子洗出，配制成孢子懸浮液（１０６～１０７ CFU／ｍＬ）。將孢子懸浮液加入４０～５０ ℃待凝固的培養(yǎng)基內(nèi)，充分搖勻使培養(yǎng)基內(nèi)孢子濃度約為１０３～１０４ CFU／ｍＬ，倒平板（１５ ｍＬ／皿左右）后用無(wú)菌鑷子將牛津杯輕輕放置于平板上，在杯內(nèi)加入１００ μＬ待測(cè)無(wú)菌發(fā)酵液，無(wú)菌風(fēng)吹干，置于２８ ℃培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈直徑。

１．3培養(yǎng)基的篩選

待篩選的培養(yǎng)基：ＢＰＤＢ（馬鈴薯２００ ｇ，牛肉膏２０ ｇ，葡萄糖２０ ｇ，蒸餾水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ自然）、ＢＰＹ（牛肉膏５ ｇ，酵母膏５ ｇ，葡萄糖５ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．２）、ＩＦＦＩ２４Ｍ（牛肉膏５ ｇ，酵母膏５ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，葡萄糖１０ ｇ，乳糖５ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ６．８）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（牛肉膏３０ ｇ，蛋白胨５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２）、ＬＢ （酵母膏５ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａＣｌ １０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０）和ＮＡ液體培養(yǎng)基（牛肉膏３ ｇ，蛋白胨５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ６．６～７．０）。

將在ＰＤＡ培養(yǎng)基上培養(yǎng)４８ ｈ的拮抗菌株ＴＣ－１配成懸浮液（１０６～１０７ ＣＦＵ／ｍＬ），取２００ μＬ分別接種于盛有２０ ｍＬ培養(yǎng)液的５０ ｍＬ三角瓶中， ２９ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ 振蕩培養(yǎng)２４、３６、４８、６０和７２ ｈ后，制備無(wú)菌發(fā)酵液，以抑菌圈直徑大小確定最佳培養(yǎng)基。

１．4培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按Ｌ２５（５６）正交表進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化試驗(yàn)，通過(guò)抑菌圈直徑確定最優(yōu)培養(yǎng)基成分。設(shè)置3因素５水平試驗(yàn)（表1）。

１．5發(fā)酵條件優(yōu)化

將ＴＣ－１接種到１．4優(yōu)化得到的最優(yōu)培養(yǎng)基，按Ｌ２５（５６）正交表進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)，以裝瓶量（Ａ）、培養(yǎng)溫度（Ｂ）、初始ｐＨ（Ｃ），發(fā)酵時(shí)間（Ｄ）和轉(zhuǎn)速（Ｅ）為試驗(yàn)因素，每因素設(shè)５個(gè)水平（表２）。通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

２結(jié)果與分析

２．１培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

用６種供篩選的培養(yǎng)基培養(yǎng)ＴＣ－１得到的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑如表３。從表３中可看出，除ＢＰＤＢ培養(yǎng)基外，其他５種培養(yǎng)基在２４ ｈ時(shí)均無(wú)抑菌活性；３６和４８ ｈ時(shí)ＢＰＤＢ培養(yǎng)基的抑菌圈直徑分別為２１．５ ｍｍ和２０．７ ｍｍ；６０ ｈ時(shí)ＢＰＤＢ、ＢＰＹ和ＩＦＦＩ２４Ｍ的抑菌圈直徑無(wú)顯著差異，分別為１６．７、１８．５和１８．５ ｍｍ；７２ ｈ時(shí)抑菌圈直徑最大的是ＩＦＦＩ２４Ｍ，為１９．７ ｍｍ；而ＢＰＤＢ與ＢＰＹ的抑菌圈直徑無(wú)顯著差異，分別為１５．７ ｍｍ和１５．２ ｍｍ；ＴＣ－１在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)３６、４８、６０和７２ ｈ后得到的無(wú)菌發(fā)酵液平均抑菌活性最大的是ＢＰＤＢ培養(yǎng)基，其平均抑菌圈直徑為１８．８ ｍｍ。ＴＣ－１在ＢＰＤＢ培養(yǎng)基培養(yǎng)３６ ｈ后無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑明顯大于其他培養(yǎng)基。故以ＢＰＤＢ培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化。

２．２培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

從培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果（表４）可以看出，各培養(yǎng)基成分對(duì)無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性均有顯著影響，影響主次排序?yàn)镃、Ｂ、Ａ，即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌活性影響最大。從表４得到最佳培養(yǎng)條件組合為Ａ４Ｂ３Ｃ２。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)２４ ｈ發(fā)酵液的抑菌圈直徑為１９．０ ｍｍ，３６ ｈ為２３．０ ｍｍ，４８ ｈ為１９．０ ｍｍ，６０ ｈ為１７．０ ｍｍ，７２ ｈ為１６．０ ｍｍ。在３６ ｈ時(shí)的抑菌圈直徑最大（圖１），與培養(yǎng)基優(yōu)化所得結(jié)果相符。后續(xù)的試驗(yàn)將７ ｇ玉米粉和７ ｇ蛋白胨加入BＰＤＢ培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。

２．３發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果如表５，各因素Ｒ值排序?yàn)椋海?、Ａ、E、D、Ｃ，即最主要的影響因素是培養(yǎng)溫度。最佳發(fā)酵條件為Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ５、Ｅ５，即在裝瓶量２０％，培養(yǎng)溫度２７ ℃，初始ｐＨ ５，發(fā)酵時(shí)間７２ ｈ，搖床轉(zhuǎn)速２４０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)條件下得到的無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)。最佳發(fā)酵條件下得到的無(wú)菌發(fā)酵液抑菌圈直徑為２４．３ ｍｍ，比優(yōu)化前抑菌活性（抑菌圈直徑２０．７ ｍｍ）提高了１７．４％。

３小結(jié)與討論

本試驗(yàn)以無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性作為指標(biāo)，篩選和優(yōu)化得到最利于ＴＣ－１菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基配方，并進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)條件為：裝瓶量２０％，培養(yǎng)溫度２７ ℃，初始ｐＨ ５，發(fā)酵時(shí)間７２ ｈ，搖床轉(zhuǎn)速２４０ ｒ／ｍｉｎ，在最佳培養(yǎng)基和最優(yōu)化發(fā)酵條件培養(yǎng)下，無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性較高，比優(yōu)化前抑菌活性提高了１７．４％。

香蕉枯萎病是土傳性真菌病害，目前通過(guò)化學(xué)防治和選育抗病品種進(jìn)行防治效果并不理想，通過(guò)篩選生防菌對(duì)該病進(jìn)行防治是一條值得探索的途徑［７－１２］。許多學(xué)者對(duì)香蕉枯萎病的生物防治進(jìn)行了研究［２，１３－１５］，但是還有許多工作需要深入。本研究對(duì)香蕉枯萎菌有抑制作用的海洋細(xì)菌ＴＣ－１發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，有望為進(jìn)一步開發(fā)利用發(fā)酵液進(jìn)行病害防治提供參考。

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（責(zé)任編輯王貴春）

收稿日期：２０１１－０８－０１

基金項(xiàng)目：廣東省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（２００９Ｂ０２０３１００１６）；廣東海洋大學(xué)海洋微生物團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：易潤(rùn)華（１９７３－），男，江西宜春人，副教授，博士，主要從事植物病害生物防治工作，（電話）１５８１２３９１３６２（電子信箱）ｓｃｉｂｙｒｈ＠１６３．ｃｏｍ。