定向誘導基因組局部突變技術研究及應用進展

雷偉俠 黃安群 范志雄 江瑩芬 榮松柏 李強生 段曉麗 陳鳳祥

摘要：定向誘導基因組局部突變（ＴＩＬＬＩＮＧ）技術是反向遺傳學中研究功能基因的一種全新的方法。ＴＩＬＬＩＮＧ技術借助高通量檢測手段，快速有效地從突變群體中鑒定出點突變。系統介紹了ＴＩＬＬＩＮＧ技術的基本原理和技術路線，同時總結了ＴＩＬＬＩＮＧ技術本身有待解決的一些問題。

關鍵詞：定向誘導基因組局部突變（ＴＩＬＬＩＮＧ）技術；反向遺傳學；點突變；檢測

中圖分類號：Ｑ７８１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）03－0445-05

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ＴＩＬＬＩＮＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＬＥＩ Ｗｅｉ－ｘｉａ１，ＨＵＡＮＧ Ａｎ－ｑｕｎ２，ＦＡＮ Ｚｈｉ－ｘｉｏｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｙｉｎ－ｆｅｎ１，ＲＯＮＧ Ｓｏｎｇ－ｂｏ１，

ＬＩ Ｑｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＤＵＡＮ Ｘｉａｏ－ｌｉ１，ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ－ｘｉａｎｇ１

（１． Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｎｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｅｆｅｉ ２３００３１， Ｃｈｉｎａ：

２． Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００１１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ａ ｎｏｖｅ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｈａｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｔｈｅ ＴＩＬＬＩＮＧ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇy ａｎｄ ｉｔｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｕｔｉｎｅ were introduced． Meanwhile， ｓｏｍｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ＴＩＬＬＩＮＧ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）； ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ； ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

誘導突變一直是遺傳學發展的主要動力之一。在各種誘變方法中，化學誘變應用特別普遍。化學誘變劑中的烷化劑類能與核苷酸結合，從而造成互補堿基的錯配，進而引起復制后的堿基系列改變。例如ＥＭＳ（甲基磺酸乙酯）使鳥嘌呤（Ｇ）烷基化，生成Ｏ６－鳥嘌呤，后者能與胸腺嘧啶（Ｔ）配對而不再與胞嘧啶（Ｃ）配對［１］。適宜濃度的ＥＭＳ誘變具有染色體斷裂較少（染色體斷裂可引起突變體染色體非整倍化、不育甚至顯性致死）、點突變頻率高的優點，因此ＥＭＳ的誘變效果通常比較好［１，２］。

化學誘變劑處理后產生的突變多為點突變，其中發生在蛋白質編碼區的突變可分為三類：無義突變、沉默突變、錯義突變。對于功能基因而言，ＥＭＳ誘導的點突變可產生靜息基因（ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ或ｓｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ）、條件型等位基因（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅ）或只影響特定的蛋白質結構域，所有這些突變型對闡釋目標基因的功能非常有益［３］。

隨著大規模測序數據的積累，科學家們對基因組的注意力從基因的結構轉向基因的功能，而這就依賴于反向遺傳學的發展［４］。反向遺傳學研究方法常分為兩類，一是特定目標位點的定向誘變，另一個就是全基因組范圍內的誘變和篩選。前者常用反義ＲＮＡ抑制或ＲＮＡ干擾（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）來實現，后者常用Ｔ－ＤＮＡ隨機插入或轉座子標簽法來實現［５］。但是，要獲得并分析基因組中每個基因的敲除突變體并不容易。目前，對ＲＮＡｉ的研究十分熱門，然而ＲＮＡｉ的功效仍舊不明朗，主要表現在后代表型的多樣性及不可預見性。同時，由于上述技術均依賴于農桿菌介導轉化或內源標簽系統，需耗時的轉基因和復雜的組織培養技術，作為常規方法加以應用目前僅限于少數物種。當然，還有一些其他研究方法，但都存在不少問題（表１）。因此，在擬南芥等模式生物測序完成后，迫切需要一種新的兼具自動化、適用性廣、突變率高的反向遺傳學工具用于功能分析。ＴＩＬＬＩＮＧ技術就是在這一背景下應運而生的［６］。

１ＴＩＬＬＩＮＧ技術的原理

ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）技術是美國華盛頓Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ癌癥研究中心以Ｓｔｅｖｅｎ為首的科學家發展建立的［７］，它將誘發產生高頻率點突變的化學誘變方法與ＰＣＲ篩選技術和高通量檢測方法有效結合，以便發現、分析目標區域點突變，是一種全新的高通量、低成本的反向遺傳學研究方法。

ＴＩＬＬＩＮＧ技術的原理是先用化學誘變劑誘發產生一系列的點突變，再根據目標基因設計特異性引物，對目標基因進行ＰＣＲ擴增，而后將ＰＣＲ擴增產物變性退火生成錯配的異源雙鏈核酸分子，利用儀器分析技術區分出純合雙鏈和異源雙鏈。為了增加通量，避免假陽性，它將突變群體若干個個體樣本的ＤＮＡ混合建池（如擬南芥ＡＴＰ項目組用８個單株建成８倍池），在檢測出含突變體的混合池后再對該池中的每個個體分別重新進行ＰＣＲ擴增，驗證混合池是否為假陽性并確定對應的突變個體。在明確突變體后，再對目標基因測序，測序結果可以再次驗證是否真的為陽性突變。

１．１群體準備

產生適合ＴＩＬＬＩＮＧ技術的誘變群體要求考慮以下因素：目標群體的遺傳組成、誘變劑的種類和處理方式、ＤＮＡ提取與建池策略等。

目標群體的遺傳組成最好比較簡單，首選純合自交系。并且為了減少親本個體間的遺傳差異，在保證能產生數千子代的前提下，應當選擇單個或盡可能少的供體親本。這方面，有些單倍體育種技術開展得比較成功的作物（如甘藍型油菜等）無疑具有比較優勢。而且只要有可能，供體親本就應當選擇大部分測序信息已經知道的株系或品種。

誘變劑應選擇點突變率高的誘變劑。ＥＭＳ由于突變密度高、使用簡便可靠而倍受青睞。擬南芥種子ＥＭＳ突變體后代中，點突變隨機分布在染色體組上，其中編碼區５％突變為編碼產物的提前終止突變，５０％為改變編碼蛋白氨基酸系列的錯義突變［８］。

誘變強度也是考慮因素之一，同樣處理的誘變方法在不同物種中的突變率相差很大。誘變會出現致死和不育現象，所以應在突變率、致死率和不育率之間找到平衡。例如果蠅ＥＭＳ誘變劑量為５０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，平均每１５５．６ ｋｂ發生一個突變（１／１５５．６ ｋｂ，下同）；當劑量提高到１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ時，突變頻率增加到１／９０．５ ｋｂ，但Ｆ２存活數從１ ９１５只（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）銳減至１７１只（１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）［３］。比較已有研究結果中的ＥＭＳ誘發突變的頻率，相差最高達４０倍。適宜濃度下最高突變率為六倍體小麥（１／２５ ｋｂ），接下來依次為四倍體小麥（１／４０ ｋｂ）［９］，果蠅（１／１５５．６ ｋｂ）［３］，擬南芥（１／１７０ ｋｂ）［８］，斑馬魚（１／２３０ ｋｂ）［１０，１１］，玉米（１／５００ ｋｂ）［１２，１３］，水稻（１／５００ ｋｂ）［１４］和大麥（１／１．４ Ｍｂ）［１５］，這些數據可能表明影響突變率的是生物體的倍性而不是基因組大小，多倍體生物可能耐受更高劑量的ＥＭＳ。但總體上，誘變處理后變異的分子機理方面的信息還不多，今后這方面的工作可能對改進ＴＩＬＬＩＮＧ技術很有幫助。

１．２ＤＮＡ取樣

ＤＮＡ取樣受到誘變劑處理方式的影響。植物中最常用的處理方式是將誘變劑配成溶液浸泡種子，這種方式雖然簡便，但Ｍ１代突變體常為嵌合體，不能對Ｍ１直接取樣，因此，需要將Ｍ１自交得到Ｍ２。在有些大型作物（如玉米）中，為了減少Ｍ２的群體大小，常采用單子傳法，但這樣會損失２５％的突變體。另外一種較省時的方法是處理植物的花粉后給供體親本授粉，得到雜合的Ｍ１，這樣就可以對每一個Ｍ１單株取樣。Ｍ１自交得到的Ｍ２群體實際上是由多個家系構成的，可以提供豐富的遺傳信息。利用花粉誘變，Ｔｉｌｌ等［１２，１３］成功獲得了由７５０個單株組成的群體，以１１個感興趣的基因為目標，從中檢測出１７個突變體。這個實驗可能對其他作物的誘變方式有指導意義。圖１表明了兩種處理方式的差異［１６］。

為了降低成本，ＴＩＬＬＩＮＧ技術采取類似分子標記篩混合池的策略：將群體中的若干個單株ＤＮＡ樣混合作為模板擴增。每個混合池中的樣本容量與檢測突變的靈敏度間有一個最合適的拐點，超過這個拐點，隨著混合池中樣本容量的增加，每個池中的雜合雙鏈的比率會減小，檢測的靈敏度也因此降低，因此每個物種應當根據倍性找到最適合自己的拐點。Joy等［１７］在對老鼠ＴＩＬＬＩＮＧ的研究中比較了１∶２、１∶５、１∶１０、１∶１５和１∶２０共５組混合池的檢測靈敏度，發現１∶１０混合池在靈敏度和成本間達到平衡，而擬南芥ＴＩＬＬＩＮＧ項目組采取８個單株混合的方法，每板ＰＣＲ板因此能檢測７８４個（９８×８）單株，檢測效率也非常高［６］，混合池也可采用二維點陣法排列［１８］。

１．３引物設計與ＰＣＲ擴增

按目標基因序列設計引物，是ＴＩＬＬＩＮＧ技術的一個重要步驟，設計的好壞直接影響ＴＩＬＬＩＮＧ的篩選效果。Ｎｉｃｋ等專門為擬南芥ＴＩＬＬＩＮＧ項目研究開發了ＣＯＤＤＬＥ程序。ＣＯＤＤＬＥ不僅能識別各種形式的序列信息，按輸入的堿基序列產生基因模型和蛋白質保守區域模型，也能列出ＥＭＳ誘導植株產生有害突變的可能范圍。當１ｋｂ左右的區段被選中后，研究人員可用Ｐｒｉｍｅｒ３程序設計引物［１９］。

ＴＩＬＬＩＮＧ的ＰＣＲ最適合的退火溫度由引物特性來確定，一般可使用Ｐｒｉｍｅｒ３程序給出的最適溫度。退火溫度一般較高，以保證擴增產物的特異性。如果目標產物的產率不高的話，則可以用巢式ＰＣＲ策略提高產率，如Ｓｙｌｋｅ等［３］用總共１０套引物通過３輪巢式ＰＣＲ成功擴增出了３個不同基因（Ｓａｒａ，Ａｌｐ２３Ｂ和Ａｒｆ６）。

１．４點突變的檢測與鑒定

點突變的檢測一直是遺傳學的一道難題。要得到好的結果，不僅要求檢測儀器靈敏度高，還要能夠準確識別假陽性位點。對誘變后代目標基因進行測序當然是個可行的辦法，但當誘變群體比較大時，對每個后代個體進行測序的成本太高，測序法當然不現實。如果能先利用ＰＣＲ擴增目標基因，再快速區分ＰＣＲ產物，就可以將成本降至最低。現代儀器分析技術與ＴＩＬＬＩＮＧ的結合很好地實現了這一設想。這些技術包括變性高效液相色譜（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）、毛細管電泳（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）和雙色紅外熒光檢測技術，它們主要依賴色譜或電泳時的遷移率不同而實現ＰＣＲ產物的分離。

將酶學技術引入ＴＩＬＬＩＮＧ又一次引起ＴＩＬＬＩＮＧ技術的飛躍。新技術體系是將ＰＣＲ產物先變性，然后復性，如此一來，只要混合池中有一條目標基因的突變鏈，復性后的雙鏈中就會有一條來自突變型而另一條來自野生型，錯配處形成環，此時利用一種特異的內切酶酶切錯配堿基［２０］，通過ＤＨＰＬＣ、ＣＥ或凝膠電泳就可以將野生型片段和被切斷的突變型片段分開，并且錯配堿基被切后的突變型片段長度和被切片段之和應當等于野生型片段長度，突變的位置也可據此判斷出來。

Ｃｅｌ Ⅰ是ＴＩＬＬＩＮＧ中常用到的一種錯切酶，它是Ｓ１核酸酶家族中的一員。但與其他成員不同的是它更偏好高效切開小的錯配ＤＮＡ系列。該酶還具有ＤＮＡ５末端外切酶活性，所以在進行ＴＩＬＬＩＮＧ時應當仔細控制Ｃｅｌ Ⅰ的反應條件以避免它將底物降解［６］。Ｃｅｌ Ⅰ由一家公司商業化生產，價格較高，不少研究者找到了它的替代品。Ｗｕ等［２１］比較了ＭＢＮ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）和Ｃｅｌ Ⅰ的錯切效率，結果表明所有Ｃｅｌ Ⅰ能切的錯配均能被ＭＢＮ切割。而且Ｃｅｌ Ⅰ也可從白菜葉柄或芹菜汁中提取［２２］。

由于色譜柱只是單柱系統，ＤＨＰＬＣ檢測一次只能進一個混合樣。毛細管電泳技術能一次分析９６個混合池的ＰＣＲ產物，但Ｒａｍａｎ等［２３］比較了毛細管電泳技術和測序技術分析突變體庫的效果，卻發現當外顯子較小、ＳＮＰ頻率較高且外顯子間有多個內含子的插入／缺失多態性時，ＴＩＬＬＩＮＧ技術應用起來比較麻煩。

而雙色紅外熒光檢測技術則彌補了上述兩種檢測技術的缺陷。為了用熒光檢測技術檢測ＣｅｌⅠ酶切產物，事先要在ＰＣＲ反應體系中加入熒光標記引物。雜質、干擾分子在紅外光區幾乎不發光，所以用紅外熒光檢測的背景非常低，并且兩個通道波長相距較遠，幾乎無光譜重疊的干擾，從而保證了ＴＩＬＬＩＮＧ分析中每個突變堿基的準確識別及整個檢測的靈敏度。Trenton等［２４］在反應體系中加入用ＩＲＤ７００標記的正向引物和ＩＲＤ８００標記的反向引物，擴增產物在平板膠上電泳，然后分別用７００ ｎｍ和８００ ｎｍ兩個通道的波長檢測，得到兩張電泳圖，再用ＵＮＩＸ程序“ｇｒａｂ”（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．Ｉｍａｇｅｍａｇｉｃｋ．ｏｒｇ）將ＬＩ－ＣＯＲ掃描儀上的圖像文件處理成適合于Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ分析的ＪＰＥＧ壓縮文件。

采用熒光標記應當注意兩個問題：①引物用熒光標記之后，擴增效率會下降；②ＩＲＤ８００標記的引物活性比ＩＲＤ７００標記的弱，所以８００ ｎｍ通道的信號比７００ ｎｍ的弱。Trenton等［２４］在反應體系中按不同比例混入未標記的引物，其中正向引物標記的與未標記的比例為３∶２，而反向引物比例為４∶１，從而解決了這兩個問題。

２Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ：ＴＩＬＬＩＮＧ技術的進一步發展

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ是ＴＩＬＬＩＮＧ技術的變通，只是前者針對自然群體而后者針對誘變后代。自然群體中，Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ ４種堿基均可能發生突變，所以Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ檢測出的ＳＮＰ可能發生在目標基因的任一堿基，有別于ＴＩＬＬＩＮＧ時的Ｇ堿基突變。

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ對難以誘變的生物（如某些樹木）和人類反向遺傳學特別合適。它可以區分群體中目標基因的基因型，也可以分析群體的遺傳多樣性。當然，這種體系中，應在混合池中加入對照的ＤＮＡ以產生目標基因的雜合雙鏈。如Ｌｕｃａ等［２５］用Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ篩選了哥倫比亞生態型擬南芥１９２個株系，結果發現Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ完全可以有效發現目標基因的ＳＮＰ，結合ＣｅｌⅠ酶切提供的位置信息，可以很容易區分出單模標本（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）。Ｅｒｉｎ等［２６］收集三角葉楊４１個不同群體，以不列顛哥倫比亞大學植物園的一個群體為對照，確定９個基因為研究對象，調查該樹種的遺傳多樣性，結果發現這些基因中ＳＮＰ從１個至２３個不等，總體上核苷酸多樣性相對較低（πｔｏｔａｌ＝０．００１ ８４），作者認為對大范圍研究樹木自然變異而言，Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ比測序法更有效。人類基因組測序完成后，人們發現個體基因組上核苷酸只有０．１％的差異。但如果要將這０．１％的差異歸為人與人不同的根本原因，顯然是高估了，因為有些ＳＮＰ并不是功能基因上的多態性。并且，有些ＳＮＰ在人群中并不具有普遍性（普遍性指大于５％），但那些稀有型（小于５％）ＳＮＰ也很可能是遺傳病的根本原因，用Ｓａｎｇｅｒ測序法分析這些稀有型ＳＮＰ或發現新的ＳＮＰ效率太低并且成本過高，而Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ可以很好解決這個問題［１８］。

３ＴＩＬＬＩＮＧ有待解決的問題

雖然ＴＩＬＬＩＮＧ是反向遺傳學研究領域的一把利器，但在實際應用中有些技術尚需改進。

１）誘變強度（包括誘變劑濃度、處理時間）和處理方式是影響ＴＩＬＬＩＮＧ效果的很重要的因素。如前文所述，不同文章報道的誘變結果相差很大。雖然有多倍體可能更耐ＥＭＳ處理的推測，但針對不同物種何種誘變強度和處理方式最佳，實際工作中常常只能憑經驗來確定，今后可能還要在這方面做系統的研究［１６］。

２）突變體的保存也是個問題。對多個功能基因的研究是相當費時的工作，在研究完成前，如何保存突變體？對植物而言，低溫保存可以解決這個問題。而對動物來說，就比較難了。Ｓｔｅｍｐｌｅ領導的研究小組收集了６ ０００條斑馬魚用于ＴＩＬＬＩＮＧ計劃，如此大的群體，飼養工作和飼養空間無疑增加了實驗成本，而且由于壽命限制，還必須在魚死亡前完成突變體檢測和表型驗證工作。期間部分個體的死亡不可避免，而這些個體可能就是突變基因的載體［２７，２８］。

３）功能基因的突變與對應突變表型的分析仍然有大量工作要做。一旦點突變被發現后，對那些引起編碼蛋白功能損傷的突變就要進行表型分析。但化學誘變引入了大量點突變，使得表型分析變得相對困難。例如ＭａＣａｌｌｕｍ等首次報道了用ＴＩＬＬＩＮＧ研究甲基化酶ＣＭＴ３等位基因，但一年多以后才完成詳細的表型分析。ＴＩＬＬＩＮＧ突變體越多，表型鑒定就越慢。而且，除了敲除突變，等位基因還可能有其他差異表達，所以下游工作變得更復雜。在基因組存在大量背景突變的前提下，如何避免把背景突變的表型誤檢為目標基因的表型，這些問題，就連ＴＩＬＬＩＮＧ領域的權威Ｓｔｅｖｅｎ等人［６］也感到“如同潮水般涌現的基因組測序結果一樣，突然出現的大量突變體材料令每個研究人員束手無策”。也許，解決這個問題還得依靠多國科學家共同努力。

參考文獻：

［１］ ＡＳＨＢＵＲＮＥＲ Ｍ． Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ［Ｍ］． ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９０．

［２］ ＨＡＵＧＨＮ Ｇ，ＳＯＭＥＲＶＩＬＬＥ Ｃ Ｒ． Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ－ｐｌａｎｔ ｌｅｖｅｌ ［Ａ］． ＬＥＢＡＲＯＮ Ｈ Ｍ， ＭＵＭＭＡ Ｒ Ｏ，ＨＯＮＥＹＣＵＴＴ Ｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Bｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Aｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Cｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｍ］． Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８７.９８-１０７．

［３］ ＳＹＬＫＥ Ｗ，ＡＮＪＡ Ｓ，ＤＡＮＡ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｓｃｒｅｅｎ ｂｙ ＴＩＬＬＩＮＧ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５， １５：７１８－７２３．

［４］ ＣＬＡＩＲＥ Ｍ Ｍ，ＬＵＣＡ Ｃ，ＥＬＩＺＡＢＥＴＨ Ａ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ） ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，１２３：４３９-４４２．

［５］ ＥＲＩＮ Ｊ Ｇ，ＧＥＯＲＧＥ Ｗ Ｈ． ＴＩＬＬＩＮＧ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｐｌｏｕｇｈ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ，２００５，８：２１１－２１５．

［６］ ＳＴＥＶＥＮ Ｈ，ＬＵＣＡ Ｃ． Ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，２００３，５４：３７５－４０１．

［７］ ＣＬＡＩＲＥ Ｍ Ｍ，ＬＵＣＡ Ｃ，ＥＬＩＺＡＢＥＴＨ Ａ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，１８：４５５－４５７．

［８］ ＥＬＩＺＡＢＥＴＨ Ａ Ｇ， ＣＨＲＩＳＴＩＮＥ Ａ Ｃ， ＮＩＣＨＯＬＡＳ Ｅ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１６４：７３１－７４０．

［９］ ＡＮＮ Ｊ Ｓ， ＳＵＳＡＮ Ｉ Ｆ， ＤＡＹＮＡ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ， ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｗｈｅａｔ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｂｙ ＴＩＬＬＩＮＧ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１２：１－７．

［１０］ ＤＲＡＰＥＲ Ｂ Ｗ，ＭＣＣＡＬＬＵＭ Ｃ Ｍ，ＳＴＯＵＴ Ｊ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ （ＥＮＵ）－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２００４，７７： ９１－１１２．

［１１］ ＷＩＥＮＨＯＬＤＳ Ｅ，ＶＡＮ ＥＥＤＥＮ Ｆ，ＫＯＳＴＥＲＳ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ２００３，１３：２７００－２７０７．

［１２］ ＴＩＬＬ Ｂ Ｊ，ＢＵＲＴＮＥＲ Ｃ，ＣＯＭＡＩ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００４，３２，２６３２－２６４１．

［１３］ ＴＩＬＬ Ｂ Ｊ，ＲＥＹＮＯＬＤＳ Ｓ Ｈ，ＷＥＩＬ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＴＩＬＬＩＮＧ［Ｊ］． ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，２００４， ４：１－８．

［１４］ ＷＵ Ｊ Ｌ，ＷＵ Ｃ Ｊ，ＬＥＩ Ｃ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ－ａｎｄ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ＩＲ６４ ｆｏｒ ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００５，５９：８５-９７．

［１５］ ＤＡＶＩＤ Ｇ Ｃ，ＮＩＣＯＬＡ Ｍ，ＰＡＵＬ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ bａｒｌｅｙ （Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，４０：１４３－１５０．

［１６］ ＬＵＣＡ Ｃ，ＳＴＥＶＥＮ Ｈ． ＴＩＬＬＩＮＧ： Pｒａｃｔｉｃａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００６，４５：６８４－６９４．

［１７］ ＪＯＹ Ｋ，ＪＵＬＩＡＴＩ Ｒ，ＪＯＨＮ Ｓ Ｗ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＩＬＬＩＮＧ／ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ［ＥＢ／ＯＬ］．ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ．ｌｉｃｏｒ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／２００５／Ｔｉｌｌｉｎｇ＿Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ．ｐｄｆ．

［１８］ ＢＲＡＤＬＥＹ Ｊ Ｔ，ＴＲＯＹ Ｚ，ＥＬＩＳＡＢＥＴＨ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒａｒｅ ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００６，１３：１－１２．

［１９］ ＲＯＺＥＮ Ｓ，ＳＫＡＬＥＴＳＫＹ Ｈ． Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１３２：３６５－３８６．

［２０］ ＧＲＡＨＡＭ Ｒ Ｔ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０：１１２５－１１３０．

［２１］ ＷＵ Ｊ，ＳＵＮ Ｒ Ｆ，ＺＨＡＮＧ Ｙ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉ Ｓｃｉ，２００５，９：６５４－６５９．

［２２］ ＹＵＴＡＫＡ ＳＡＴＯ，ＫＥＮＴＡ ＳＨＩＲＡＳＡＷＡ，ＹＯＳＨＩＮＯＢＵ ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ，ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｇａｍｍａ-ｒａｙ －ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｒｉｃｅ ｂｙ ＤＮＡ ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｃｌｅａｖａｇｅ ｕｓｉｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｐｅｔｉｏｌｅ ｅｘｔｒａｃｔ［Ｊ］．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，５６：１７９－１８３．

［２３］ ＲＡＭＡＮ Ｓ，ＭＩＬＴＯＮ Ａ Ｅ，ＭＡＲＹ Ｐ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｙ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＴＩＬＬＩＮＧ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，３９（３）：２２０－２２７．

［２４］ ＴＲＥＮＴＯＮ Ｃ，ＢＲＡＤＬＥＹ Ｊ Ｔ，ＲＡＣＨＥＬ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００１，１２６：４８０-４８４．

［２５］ ＬＵＣＡ Ｃ，ＫＩＭ Ｙ，ＢＲＡＤＥＬＹ Ｊ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，３７：７７８－７８６．

［２６］ ＥＲＩＮ Ｊ Ｇ，ＧＥＯＲＧＥ Ｗ Ｈ，ＣＨＥＮＧ Ｃ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＳＮＰ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏｏｌ ｔｏ ｓｕｒｖｅｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｅｃｏ，２００６，１５： １３６７－１３７８．

［２７］ ＪＡＮＥ Ｂ． Ｓｍａｌｌ ｆｉｓｈ，ｂｉｇ ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］． ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，２：５６８－５７２．

［２８］ ＤＥＲＥＫ Ｌ Ｓ． ＴＩＬＬＩＮＧ—ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００４，５：１－６．

（責任編輯王貴春）

收稿日期：２０１１－０９－１５

基金項目：安徽省自然科學基金項目（０９０４１１０２１）；安徽省農業科學院院長青年創新基金項目（１１Ｂ０２０１）

作者簡介：雷偉俠（１９７２－），女，陜西合陽人，助理研究員，碩士，主要從事油菜分子生物技術及育種研究工作，（電話）１５８５６９４９６３５

（電子信箱）ｌｅｉｗｅｉｘｉａ２０１０＠１２６．ｃｏｍ。