瀕危植物珙桐AFLP反應體系的建立及引物篩選

李雪萍等

摘要：為研究不同生境下珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）的遺傳多樣性，以珙桐葉片為材料優化建立珙桐的ＡＦＬＰ反應體系。對酶切與連接中ＤＮＡ的濃度、預擴增的引物、選擇擴增中Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰｓ的濃度進行梯度比較分析。結果顯示，酶切與連接過程中ＤＮＡ的濃度變化對結果影響不大，預擴增的引物是否帶有選擇堿基對結果影響明顯，選擇擴增中ｄＮＴＰｓ濃度的變化對最終譜帶影響不大，而Ｍｇ２＋濃度變化會對最終譜帶產生影響，以１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ為宜。采用優化后的體系，從１２對Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４組ＡＦＬＰ選擇擴增引物組合中篩選出能夠得到清晰擴增譜帶的７組引物組合，為今后的研究奠定了基礎。

關鍵詞：珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）；ＡＦＬＰ；體系優化；引物篩選

中圖分類號：S792.99；Q503文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0831-04

珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）為珙桐科珙桐屬落葉大喬木，是我國特有的單型屬孑遺植物，是國家一級保護植物［１］。珙桐天然分布在貴州、湖南、湖北、陜西、四川、云南及甘肅７省，分布范圍較窄，資源量較少，僅限于一些邊遠山區的人跡罕至之地［２］。珙桐素有“中國活化石”之稱，在植物系統發育和地史變遷上有很高的研究價值，對珙桐進行遺傳多樣性研究，可以為有效保護和合理利用該珍稀植物提供必要的科學依據。目前對珙桐的研究多集中在群落生物學、人工繁殖與引種栽培方面［３－８］。

ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是荷蘭科學家Ｚａｂｅａｕ等［９］和Ｖｏｓ等［10］發展起來的一種檢測ＤＮＡ多態性的方法，是在ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ基礎上發展起來的，具有很多突出的優點：所需ＤＮＡ量少，不需要預知ＤＮＡ序列信息，靈敏度高；多態性豐富，分辨率高，重復性好，假陽性低，可靠性高；共顯性。自問世以來，該技術在物種的品種鑒定、種質資源和遺傳多樣性等［１1－１3］方面的研究中被廣泛應用。

本研究對影響ＡＦＬＰ擴增體系的相關因素進行了優化篩選，初步建立了適于珙桐的ＡＦＬＰ反應體系，為進一步開展該物種遺傳多樣性的ＡＦＬＰ分析奠定了基礎。

１材料與方法

１．１材料

試驗材料為神農架木魚鎮神農架國家級自然保護區科研所旁與神農祭壇下功德林內移栽的珙桐，取其幼葉于冰壺中，帶回實驗室后置于－７０ ℃超低溫冰箱保存備用。

１．２方法

１．２．１ＤＮＡ的提取方法參考鄒喻蘋等［１4］介紹的ＣＴＡＢ法，稍做改良后提取珙桐的總ＤＮＡ［１5］。在紫外可見分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ－２８００）上，于波長２６０、２８０ ｎｍ處測定其吸光度，計算ＤＮＡ濃度；采用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠成像系統（ＢＩＯ－ＲＡＤ）觀察拍照。

１．２．２ＡＦＬＰ試驗方法

１）酶切與連接。參照Ｖｏｓ等［10］的方法，酶切與連接一步完成。２０ μＬ酶切與連接體系中包含３.00 μＬ ＤＮＡ，１２．２５μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．０0 μＬ １０×Ｔ４ Ｂｕｆｆｅｒ，０．３0 μＬ ＭｓｅⅠ（１０ Ｕ／μＬ），０．１５ μＬ ＥｃｏＲ Ｉ（２０ Ｕ／μＬ），１．０0 μＬ ＥｃｏＲ Ⅰ接頭（５ ｐｍｏｌ／μＬ），１．０0 μＬ Ｍｓｅ Ⅰ接頭（５０ ｐｍｏｌ／μＬ），０．３0 μＬ Ｔ４－ＤＮＡ連接酶（４ Ｕ／μＬ）。３７ ℃酶切與連接４ ｈ以上。其中珙桐總ＤＮＡ作梯度稀釋（２００、１００、５０、３０、１５ ｎｇ）。接頭與引物序列見表１。

２）預擴增。將酶切與連接產物用ｄｄＨ２Ｏ稀釋８倍作預擴增模板，在試驗中對不含任何堿基和含一個選擇堿基的預擴增引物（ＭｓｅⅠ－Ｃ、ＥｃｏＲⅠ－Ａ）進行篩選（表１）。２０ μＬ的預擴增體系中有３.0 μＬ模板，１０．９ μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．６ μＬ ｄＮＴＰs（10 ｍｍｏｌ／Ｌ），１．２ μＬ ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．６ μＬ Ｍｓｅ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．６ μＬ ＥｃｏＲⅠ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．１μＬ Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）。擴增程序為９４ ℃預變性２ ｍｉｎ； ９４ ℃、３０ ｓ，５６ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３０個循環；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。預擴增完成后，?。?μＬ預擴增產物在０．８％瓊脂糖凝膠中檢測預擴增的效果，剩余產物于－２０ ℃保存備用。

３）引物篩選與選擇性擴增。預擴增產物稀釋１５倍后作為選擇性擴增的模板ＤＮＡ，在預擴增引物的３′末端加上３個堿基作為選擇性擴增引物（表１），從這１２對Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４個ＡＦＬＰ選擇擴增引物組合中篩選適合珙桐的選擇擴增引物。２０ μＬ的選擇擴增體系中有５．００ μＬ模板，８．２５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．００ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．６０ μＬ ｄＮＴＰｓ（10 ｍｍｏｌ／Ｌ），１．４０ μＬ ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．８０ μＬ Ｍｓｅ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．８０ μＬ ＥｃｏＲ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．１５ μＬ Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）。擴增程序為９４ ℃預變性３ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，６５ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，退火溫度每個循環遞減０．７℃，共有１３個循環；９４ ℃、３０ ｓ，５６ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３０個循環；最后７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。

為了確定珙桐最佳的ＡＦＬＰ選擇擴增條件，選用引物ＥｃｏＲⅠ－ＡＡＣ／ＭｓｅⅠ－ＣＴＴ，以３個珙桐個體的總ＤＮＡ混合液作為模板，對ＰＣＲ的影響因素Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs作濃度梯度測試，進行單因素試驗研究，各因素與水平見表２。

４）ＰＣＲ產物檢測。選擇擴增產物加入８ μＬ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（９８０ ｇ／Ｌ甲酰胺，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２．５ ｇ／Ｌ 二甲苯氰，２．５ ｇ／Ｌ溴酚藍），混合，９５ ℃變性５ ｍｉｎ后立刻轉移到冰浴中冷卻，避光，待用。制備６％的變性聚丙烯酰胺凝膠，預電泳３０ ｍｉｎ，恒定功率９５ Ｗ，上樣擴增產物６ μＬ后繼續電泳，約２ ｈ時停止電泳。采用銀染方法顯帶，經過脫色、固定、銀染、顯影、定影等過程，膠板在室溫下自然干燥。

２結果與分析

２．１ＤＮＡ檢測結果與分析

采用改良后的ＣＴＡＢ方法提取珙桐的總ＤＮＡ，紫外可見分光光度計檢測２６０、２８０ ｎｍ處的吸光度比值A２６０ ｎｍ／A２８０ ｎｍ為１．８左右。ＤＮＡ瓊脂糖電泳圖譜條帶整齊、清晰，基本無降解，完整性好。由于ＡＦＬＰ分析對供試ＤＮＡ的要求高，所以提取高質量、高純度的ＤＮＡ是ＡＦＬＰ分析成功的關鍵之一。許多研究者認為，多糖、多酚、色素等會嚴重影響ＤＮＡ聚合酶的活性，干擾引物與模板的結合，從而導致擴增失敗。因此，在ＣＴＡＢ提取液中添加了較高濃度的ＰＶＰ４０，這樣能夠有效地去除多糖類、多酚類等物質的影響，提高ＤＮＡ的純度。ＰＶＰ４０有很強的結合多酚的能力，結合后可防止酚類氧化成醌類，避免溶液變褐而具有抗氧化作用，也可防止ＤＮＡ酶降解ＤＮＡ［１4］，同時還能有效去除多糖。

２．２ＡＦＬＰ試驗結果與分析

２．２．１酶切與連接Ｖｏｓ等［10］指出，多切點的酶產生小的ＤＮＡ片段，這些片段能很好地被擴增，適于在變性序列膠上分離，少切點的酶可減少被擴增的片段，而兩種酶組合后ＥｃｏＲ Ⅰ／Ｍｓｅ Ⅰ產生的片段才是主要擴增的片段，故采用雙酶切可以極其靈活地控制被擴增片段的大小和數目。因而，雙酶切反應進行得是否完全，將直接影響試驗結果。ＡＦＬＰ的前提是酶切要完全，而預擴增是檢測酶切與連接效果的手段。理想的預擴增產物電泳后邊緣清晰、呈紡錘形、分子量大小適當，產物片斷大小為１００～１ ０００ ｂｐ適宜。

在實際操作中，酶切與連接分步操作與酶切與連接一步進行未見差別，最終選擇酶切與連接一步進行的操作。酶切與連接中ＤＮＡ梯度變化結果顯示ＡＦＬＰ反應對模板ＤＮＡ濃度不敏感，ＤＮＡ濃度的高低變化基本沒有影響，均能得到清晰的ＡＦＬＰ圖譜，?。?μＬ ＤＮＡ稀釋液約３０ ｎｇ為目的ＤＮＡ進行酶切與連接，接頭采用通用ＭｓｅⅠ接頭、ＥｃｏＲⅠ接頭（表１）。酶切與連接后的瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖１，結果顯示彌散帶為１００～１ ０００ ｂｐ，可以繼續后面的試驗步驟。

２．２．２預擴增預擴增中發現引物不帶任何選擇堿基與帶一個選擇堿基的預擴增終產物帶型差異很大，帶一個選擇堿基的引物對應的預擴增終產物擴增條帶數量明顯減少，因此最終確定采用不帶任何選擇性堿基的引物作為預擴增引物。

２．２．３引物篩選與選擇擴增ＰＣＲ反應中，一般認為，Ｍｇ２＋濃度不僅影響Ｔａｑ酶的活性，還能與反應液中的ｄＮＴＰs、ＤＮＡ模板及引物結合，影響引物與模板的結合效率、模板與產物的解鏈溫度以及產物的特異性和引物二聚體的形成；ｄＮＴＰs是反應的原料，ｄＮＴＰs濃度過高，會導致ＰＣＲ錯配，從而使擴增出現非特異性，濃度過低又會影響合成效率［１6］。

試驗對選擇擴增時的Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs的濃度梯度優化顯示，ｄＮＴＰs的濃度變化時，產物的帶型及強弱差別不大，說明對于珙桐的ＡＦＬＰ選擇擴增來說，ｄＮＴＰs的濃度變化對產物的影響不大，如圖２所示；而Ｍｇ２＋的濃度變化有一定影響，Ｍｇ２＋的濃度較低時（１．００、１．５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）條帶較弱，條帶數量也較少，隨Ｍｇ２＋濃度的升高，條帶強度增強，即產物產量增加，當Ｍｇ２＋濃度達到１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ后，帶型趨于穩定，如圖２。最終選擇１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍｇ２＋及０．２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰs進行ＡＦＬＰ選擇擴增。

從１２對Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４個ＡＦＬＰ選擇擴增引物組合中篩選適合珙桐的引物組合，其中７個引物組合能夠得到清晰的擴增條帶，其組合見表３。

２．２．４產物檢測ＡＦＬＰ技術經歷著由同位素標記技術、生物素標記技術、銀染技術向熒光標記技術的轉化。由于同位素的不安全因素，現在部分實驗室采用生物素標記（如地高辛）代替同位素標記，其靈敏性略低于或相當于同位素，其優點是沒有放射性，對人體不會造成傷害，但采用生物素標記流程較長，步驟比同位素標記繁瑣，而且成本高。銀染技術是將擴增產物經過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用銀染方法代替放射性標記進行多態性的檢測。雖然銀染技術比同位素標記操作安全且成本較低，對人體的傷害較?。ㄣy染過程所用的甲醛也有毒害），但流程比較長，穩定性較差，染色和顯色反應受環境溫度、染色和顯影的時間及溫度、染色液和顯影液的組成等多種因素的影響，但隨著操作的逐步熟練，銀染能夠在溫度相對恒定的條件下操作，有很好的效果。本試驗就是采用了銀染技術。

此外，研究中發現ＡＦＬＰ標記的指紋式樣會因不同廠家的Ｔａｑ酶甚至不同批次的酶而異，與明軍等［１７］建立梅花基因組ＡＦＬＰ體系時的觀點一致。因此，在使用某一種酶后，應立即訂購同一廠家足夠量的同批次酶，以保證試驗的正常進行和圖譜的穩定性、可比性，盡量減少誤差。

３結論

盡管ＡＦＬＰ試驗操作較為復雜，但由于其高效性，越來越多的研究者采用ＡＦＬＰ進行相關的遺傳研究。研究通過對酶切與連接中ＤＮＡ的濃度、預擴增的引物、選擇擴增中Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs濃度的梯度比較分析，建立起適合珙桐的ＡＦＬＰ體系，為今后開展相關研究奠定了良好的基礎。

參考文獻：

［１］ 傅立國，金鑒明．中國植物紅皮書——稀有瀕危植物（第一冊）［Ｍ］． 北京：科學出版社，１９９２． ４７４－４７５．

［２］ 賀金生，林潔，陳偉烈． 我國珍稀特有植物珙桐的現狀及其保護［Ｊ］． 生物多樣性，１９９５，３（４）：２１３－２２１．

［３］ 陳大新，楊敬元． 珙桐繁育技術［Ｊ］． 湖北林業科技，２００５（５）：６１－６２．

［４］ 李尤，蘇智先，張素蘭，等． 珙桐群落種內與種間競爭研究［Ｊ］． 云南植物研究，２００６，２８（６）：６２５－６３０．

［５］ 羅世家． 珙桐組織培養研究［Ｊ］． 林業科技，２００６，３１（４）：４－６．

［６］ 李月琴，雷濘菲，林莎，等． 瀕危植物珙桐的組織培養技術研究［Ｊ］． 安徽農業科學，２００７，３５（１８）：５３７１－５３７２．

［７］ 肖開煌，蘇智先，張素蘭，等． 不同海拔珙桐群落喬木物種多樣性與土壤因子關系研究［Ｊ］． 云南大學學報（自然科學版），２００７，２９（４）：４０８－４１３．

［８］ 朱鳳去，楊艷麗．珙桐種子育苗技術［Ｊ］．黑龍江農業科學，２００８（４）：１５６．

［9］ ZABEAU M，VOS P． Selective resriction fragment amplification：a general method of DNA fingerprinting［P］． European Patent：EP0534858，2005-04-27．

［10］ ＶＯＳ Ｐ，ＨＯＧＥＲＳ Ｒ，ＢＬＥＥＫＥＲ Ｍ，ｅｔ ａl． AFLP：a ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３（２１）：４４０７－４４１４．

［１1］ 成玉，陳成彬，薛梅，等． 應用ＡＦＬＰ技術探討半夏屬五個種的親緣關系［Ｊ］． 云南植物研究，２００６，２８（６）：５５９－５６４．

［１2］ 趙麗華，李名揚，王先磊． 川滇石榴品種遺傳多樣性及親緣關系的ＡＦＬＰ分析［Ｊ］． 林業科學，２０１０，４６（１１）：１６８－１７５．

［１3］ 李明． 亞麻種質資源遺傳多樣性與親緣關系的ＡＦＬＰ分析［Ｊ］． 作物學報，２０１１，３７（４）：６３５－６４０．

［１4］ 鄒喻蘋，汪小全，雷一丁，等． 幾種瀕危植物及其近緣類群總ＤＮＡ的提取與鑒定［Ｊ］． 植物學報，１９９４，３６（７）：５２８－５３３．

［１5］ 李雪萍，何正權，陳發菊，等． 神農架４個珙桐居群遺傳多樣性的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 北京林業大學學報，２００６，２８（３）：６６－７０．

［１6］ 薩姆布魯克Ｊ，弗里奇Ｅ Ｆ，曼尼阿蒂斯Ｔ． 分子克隆實驗指南［Ｍ］． 第二版． 金冬雁，黎孟楓，譯． 北京：科學出版社，１９９３． ６１１－６１８．

［１7］ 明軍，張啟翔，晏小蘭，等． 梅花基因組ＡＦＬＰ銀染反應體系的建立和優化［Ｊ］． 北京林業大學學報，２００３，２５（３）：１７－２１．