熒光定量PCR法檢測鄰苯二甲酸酯的研究

白舟等

摘要：建立了一種利用外切酶保護－熒光定量ＰＣＲ檢測環境激素鄰苯二甲酸酯的方法。將從魚肝臟中提取含雌激素受體的細胞溶質，與不同濃度的鄰苯二甲酸酯結合，采用常規ＰＣＲ方法擴增制備雙鏈結合ＤＮＡ，將其與配體－受體復合物反應的結合物，用核酸外切酶ＥｘｏⅢ和Ｓ１核酸酶處理，消解游離ＤＮＡ，并以消解后產物作為模板，進行熒光定量ＰＣＲ擴增反應，建立Ｃｔ值與鄰苯二甲酸酯質量濃度Ｃ（ｇ／Ｌ）的對數標準曲線：Ｃｔ＝－０．２７３ ｌｇ（Ｃ）＋６．３２０。將該方法應用于水樣中鄰苯二甲酸酯的檢測，最低檢測限達到１０～１００ μｇ／ｍＬ。該法準確度高、抗干擾性強、適用于檢測大批量環境樣品中鄰苯二甲酸酯。

關鍵詞：鄰苯二甲酸酯；熒光定量ＰＣＲ；核酸外切酶

中圖分類號：Ｘ８２６；Ｘ５６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0823-04

鄰苯二甲酸酯（Ｐｈｔｈａｌａｔｅｓ）是塑料的增塑劑，用于增大產品的可塑性和提高產品的強度［１］。隨著塑料工業的迅速發展和塑料制品的廣泛應用，這類污染物已大量進入環境，普遍存在于土壤、底泥、水體、生物、空氣及大氣降塵物等環境中［２，３］，對環境的不利影響也逐漸凸顯。研究表明，鄰苯二甲酸酯具有急性毒性、致癌性和致畸性等多種生物毒性［４－６］，而且鄰苯二甲酸酯水解和光解速率都非常緩慢，已成為一種全球性的環境有機污染物，被中國環境檢測總站和美國ＥＰＡ列為優先控制污染物［７］。

目前，鄰苯二甲酸酯的檢測方法包括：氣相色譜法［８］、液相色譜法［９］、氣相色譜－質譜聯用法（ＧＣ－ＭＳ）［１０］以及熒光法［１１］等。由于這類方法檢測成本高，操作復雜，分析時間長，因此不利于對環境樣品的快速分析。

近年來，隨著生物技術的發展，利用具有高靈敏度的聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）檢測技術檢測鄰苯二甲酸酯正逐漸受到關注。目前，ＰＣＲ技術主要用于檢測鄰苯二甲酸酯的雌激素效應［１２－１５］，而直接用于檢測環境樣本中鄰苯二甲酸酯含量的研究報道較少。

鄰苯二甲酸酯作為雌激素受體的配體，能夠與雌激素受體結合并能誘導雌激素受體介導的基因表達，其作用過程為：鄰苯二甲酸酯與細胞膜或細胞質中的雌激素受體結合，然后這種結合體遷移到細胞核并與核內ＤＮＡ上雌激素反應位點結合，上行調節雌激素響應基因的轉錄和翻譯，翻譯產物蛋白質進入相應的靶組織或靶器官，從而引起雌激素效應［１６］。根據此原理，建立檢測鄰苯二甲酸酯的核酸外切酶保護－熒光定量ＰＣＲ分析方法。用鄰苯二甲酸酯誘導雌激素受體與特異性的雙鏈ＤＮＡ結合，游離的ＤＮＡ被Ｓ１核酸酶降解，以酶切產物作為模板，進行熒光定量ＰＣＲ反應。由于傳統的酶切保護分析方法［１７］靈敏度低，假陽性率高。本試驗在傳統酶切保護基礎上，進一步利用Ｓ１核酸酶完全切除ＥｘｏⅢ酶切后留下的單鏈，使游離的ＤＮＡ不能被擴增，并結合ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ熒光定量ＰＣＲ技術對水樣中ＰＡＥｓ含量進行檢測。

１材料與方法

１．１試劑

鄰苯二甲酸二甲酯，ＰＣＲ試劑盒，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ＰＣＲ ｍｉｘ，核酸外切酶ＥｘｏⅢ，Ｓ１核酸酶，其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司生產。

主要實驗儀器包括ＵＶ－２０００紫外分光光度計、Ｒｏｔｏｒ－ｇｅｎｅ ３０００熒光定量ＰＣＲ儀、ＤＹＹ－１１型電泳儀（北京市六一儀器廠）、Ｔａｎｏｎ－２５００Ｒ數碼凝膠圖像處理系統（上海天能科技有限公司）。

１．２引物設計

利用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０引物設計軟件設計含有雌激素反應位點的上下游引物，由上海英駿生物科技有限公司合成。引物序列如下：上游引物Ｒ１： ５′ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＧ ３′；下游引物Ｒ２： ５′ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＧ ３′。下劃線標明了雌激素反應位點，模板為稀釋５０倍后的ｐＵＣ１９質粒［１８］。

１．３方法

１．３．１含有受體細胞溶質的提取取體長為１２ ｃｍ左右的鯉魚（２０尾），用含０．０５ ｍｇ／Ｌ的鄰苯二甲酸酯的水喂養兩周后，取魚肝臟，用冰上預冷的０．１５ ｍｏｌ／Ｌ氯化鉀溶液去除肝臟外血液后，吸干其表面水分，按照ｍ（肝臟，ｍｇ）∶ｖ（緩沖液，ｍＬ）＝１∶４的比例加入ＨＥＤＧ緩沖液（冰上預冷）后勻漿。勻漿液于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１ ｈ，收集上清，即為含有雌激素受體的細胞溶質，分裝后于－８０ ℃保存備用。

１．３．２ 結合ＤＮＡ的制備每５０ μＬ擴增體系中包含：滅菌雙蒸水３６ μＬ、ｐＵＣ１９質粒模板工作液２ μＬ、１０倍ＰＣＲ緩沖液５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的四種核苷酸的混合物（ｄＮＴＰｓ）１ μＬ、上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各２ μＬ、２ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶２ μＬ。常規ＰＣＲ循環步驟：預變性９４℃、５ ｍｉｎ；變性９４ ℃、３０ ｓ；退火５８ ℃、４０ ｓ；延伸７２ ℃、４０ ｓ；循環３０次，最終延伸７２ ℃、５ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物于質量分數為１％的瓊脂糖凝膠電泳分離，用ＰＣＲ產物快速純化試劑盒純化回收。

１．３．３配體－受體－結合ＤＮＡ復合物的制備與酶切將１ ｇ／Ｌ的ＰＡＥｓ按１０倍比稀釋為1.0×１0-1 ｇ／Ｌ～1.0×１0-9 ｇ／Ｌ，各取１０μＬ，加入細胞溶質２５０ μＬ，于２０ ℃振蕩溫育２ ｈ。加入０．２ ｍＬ質量分數為６０％的羥基磷灰石（ＨＡＰ）混勻，冰浴３０ ｍｉｎ， 在４℃以３ ５００ ｒ／ｍｉｍ離心１ ｍｉｎ，棄上清。上述沉淀中加入１ ｍＬ含質量分數為０．０５％ Ｔ－８０的ＨＥＤＧ緩沖液，同條件離心１５ ｍｉｎ，重復３次，最后1次棄上清，加入０．２ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液０．４ ｍＬ，間歇振蕩３次，離心１５ ｍｉｎ，取上清，即為配體－受體復合物。

從上述不同濃度配體－受體復合物中，每管取出２０ μＬ于１．５ ｍＬ小管中，加入２ μＬ結合ＤＮＡ，繼續２０℃溫育１５ ｍｉｎ，此時溶液中為配體－受體－結合ＤＮＡ復合物。

酶切步驟：從上述配體－受體－結合ＤＮＡ復合物中各取１２ μＬ于１．５ ｍＬ小管中，加入２ μＬ ＥｘｏⅢ核酸外切酶緩沖液，６ μＬ Ｈｅｐｅｓ緩沖液，使總體積為２０ μＬ，混勻后３７℃溫育１５ ｍｉｎ；每管再加入ＥｘｏⅢ １００ Ｕ，混勻后于３７℃溫育１５ ｍｉｎ；按照體積比為１∶３的比例，加入Ｓ１核酸酶（２ Ｕ／μＬ）混合液，３７℃溫育３０ ｍｉｎ；再各加入４ μＬ Ｓ１核酸酶終止液，７０℃滅活１０ ｍｉｎ，得到熒光定量ＰＣＲ的模板。

１．４熒光定量ＰＣＲ條件

每２０ μＬ體系中包含ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １０ μＬ（ＭｇＣｌ２最佳質量濃度為２ μｍｏｌ／Ｌ）、上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ、配體－受體結合ＤＮＡ復合物酶切產物作為模板２．５ μＬ、滅菌雙蒸水５．５ μＬ。熒光定量ＰＣＲ循環步驟：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ，９４ ℃變性３０ ｓ，５８℃退火４０ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，循環４０次，最后在７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。

２結果與分析

２．１結合ＤＮＡ的凝膠電泳分析

常規ＰＣＲ擴增后產物于質量分數為１％的瓊脂糖凝膠電泳分析（圖１）。結合ＤＮＡ為長度１ ０２４ ｂｐ的雙鏈ＤＮＡ，與設計的雙鏈ＤＮＡ長度相符。用ＰＣＲ產物快速純化試劑盒純化回收后，用紫外分光光度法測得ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ值為１．８６，表明回收ＤＮＡ純度高。

２．２配體－受體復合物的ＳＰＲ鑒定

表面等離子體共振（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）技術具有免標記、實時在線檢測、高靈敏度、非破壞性及高選擇性等優點［１８］。本試驗采用ＳＰＲ定性鑒定雌激素受體蛋白與鄰苯二甲酸酯結合情況（圖２、３）。

隨著復合物中加入鄰苯二甲酸酯配體濃度的增加，配體－受體復合物的ＳＰＲ響應強度增強。在加入鄰苯二甲酸酯濃度在1.0×10-9～１.0 ｇ／Ｌ范圍內，鄰苯二甲酸酯配體濃度與受體－配體復合物的ＳＰＲ響應強度之間基本呈線性關系。說明在此濃度范圍內，加入含雌激素受體的細胞質為２５０ μＬ時，鄰苯二甲酸酯可與雌激素受體結合。

２．３不同濃度鄰苯二甲酸酯誘導結合ＤＮＡ的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ熒光定量ＰＣＲ

以不同濃度的鄰苯二甲酸酯制備的配體－受體－結合ＤＮＡ復合物，經過外切酶保護處理，作為熒光定量ＰＣＲ模板進行擴增，擴增曲線見圖４和圖５。鄰苯二甲酸酯配體質量濃度Ｃ（ｇ／Ｌ）對數與Ｃｔ值具有線性關系，兩者關系式為Ｃｔ＝－０．２７３*ｌｏｇ（Ｃ）＋６．３２０，Ｒ２＝０．９９４ ８，本方法對鄰苯二甲酸酯的檢出限為１０－１０ ｇ／Ｌ，在低濃度水平下，Ｃｔ并未出現顯著變化。

本試驗的受試水樣來源于松江東華大學北側的張家浜河河水，樣本經過預處理后進行檢測，結果如圖６所示，其線性檢測范圍為１０～１００ μｇ／ｍＬ。

２．４特異性分析

將多氯聯苯和雙酚Ａ代替鄰苯二甲酸酯后，按１．４中所述方法進行熒光定量ＰＣＲ擴增，未發現擴增信號，表明多氯聯苯和雙酚Ａ并沒有與受體結合，而鄰苯二甲酸酯能與受體結合，說明此方法特異性較好。

２．５加標回收分析

用不含鄰苯二甲酸酯的水樣進行加標回收試驗。加標回收結果見表１。由結果可知，回收率為８１．６％～９７．６％，相對標準偏差為２．６９％～４．４５％。由表１可以看出，本文建立的外切酶保護－熒光定量ＰＣＲ方法準確度高，可以較好地應用于環境中鄰苯二甲酸酯的檢測。

３結論

建立了一種利用外切酶保護－熒光定量ＰＣＲ檢測方法，用Ｓ１核酸酶完全切除核酸外切酶ＥｘｏⅢ酶切后留下的單鏈，使游離ＤＮＡ完全不能被ＰＣＲ擴增出來，提高了靈敏度。以配體－受體－ＤＮＡ復合物為模板進行ＰＣＲ擴增，當配體－受體－ＤＮＡ復合物中加入的鄰苯二甲酸酯質量濃度在１０－９～１０－１ ｇ／Ｌ范圍內時，鄰苯二甲酸酯對數濃度與Ｃｔ值線性關系為Ｃｔ＝－０．２７３ｌｇ（Ｃ）＋６．３２０。水樣樣本的檢測范圍達１０～１００ μｇ／ｍＬ。該方法可同時處理多個樣品，且靈敏度高，準確性好，抗干擾性強，檢測過程僅２~３ ｈ，為高通量快速檢測環境樣品中的鄰苯二甲酸酯提供了新方法。