豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型鑒定與藥敏試驗

蔡丙嚴等

摘要：從江蘇泰州地區疑似豬傳染性胸膜肺炎發病豬采集病料，經細菌分離培養得到了３株分離株ＴＺＡ１、ＴＺＡ２和ＴＺＡ３株。經形態學檢查、ＣＡＭＰ試驗、生化試驗和血清型鑒定，確定ＴＺＡ１株和ＴＺＡ２株為血清１型，ＴＺＡ３株為血清３型。藥敏試驗顯示，３株分離菌株對恩諾沙星、阿齊霉素、頭孢唑肟高度敏感。

關鍵詞：豬胸膜肺炎放線桿菌；血清型鑒定；藥敏試驗

中圖分類號：Ｓ８５８．２８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0780-03

胸膜肺炎放線桿菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）是革蘭氏陰性、有莢膜的多形球桿菌，有時呈線性，無鞭毛，不運動，不形成芽孢。根據培養時是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ，又稱Ｖ因子），可將ＡＰＰ分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型為ＮＡＤ依賴株，包括血清型１～１２ 型和１５ 型，生物Ⅱ型的生長不依賴ＮＡＤ，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前產物以輔助生長，含有２個血清型，為血清型１３和１４［１］。豬感染ＡＰＰ后的疾病是豬傳染性胸膜肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｉａ，ＰＣＰ），急性暴發時有很高的發病率和死亡率。一些病豬康復后常伴有慢性肺炎，導致生長停滯且長期帶菌而成為其他豬的傳染源，此病給養豬業造成較大的經濟損失［２］。本研究從江蘇泰州地區部分規模豬場臨床表現為胸膜肺炎的病料中進行病原分離和血清型鑒定，并對分離菌株進行藥敏試驗，以期為泰州地區豬傳染性胸膜肺炎的防控、凈化提供理論支撐。

１材料和方法

１．１材料

ＰＰＬＯ瓊脂和ＮＡＤ購于揚州市廣陵區全球通實驗用品銷售中心；犢牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；常規培養基、生化試劑和藥敏紙片（氟苯尼考和強力霉素為自制）購于杭州天和微生物試劑有限公司；ＡＰＰ １、３、５、７、９型陽性血清購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所；金黃色葡萄球菌為本實驗室保存；待檢病料采集于泰州市規模豬場的疑似豬傳染性胸膜肺炎的病豬。

１．２試驗方法

１．２．１細菌的分離培養與形態觀察取死亡豬的氣管分泌物和肺臟作涂片，革蘭氏染色，鏡檢；同時取病料接種于含２％ ＮＡＤ的ＰＰＬＯ瓊脂平板，在５％～１０％ ＣＯ２條件下，３７ ℃培養２４ ｈ。然后挑取可疑菌落涂片，鏡檢。純培養后，以４０％甘油生理鹽水或２０％脫脂牛奶于－７０ ℃保存備用［３］。

１．２．２CＡＭＰ試驗用金黃色葡萄球菌在兔血瓊脂平板上劃一直線，再用分離菌劃線與該線垂直但不相接觸的２條直線，３７ ℃培養２４～３６ ｈ，觀察試驗結果。

１．２．3生化試驗將分離菌株分別接種含有０．０２％ ＮＡＤ的乳糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、靛基質、甲基紅、Ｖ－Ｐ試驗、硝酸鹽、衛星現象和尿素酶等微量生化試管，３７ ℃培養２４～４８ ｈ，觀察和記錄試驗結果。

１．２．4藥敏試驗檢測分離菌株對氟苯尼考、強力霉素、復方新諾明、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、氨芐西林、頭孢唑肟和阿奇霉素８種抗生素的敏感性。將保存好的菌液（濃度稀釋到１．５×１０８個／ｍＬ） 均勻涂布在ＰＰＬＯ瓊脂上， 然后將藥敏紙片貼在平皿上，培養２４ ｈ后觀察結果，并按抗菌藥物藥敏試驗判定標準判定分離菌株對不同抗生素的敏感程度［４］。

１．２．5菌株血清型鑒定將純化培養的分離菌株３７ ℃培養２４ ｈ，用生理鹽水洗下，制成生理鹽水細菌懸液。取１滴ＡＰＰ可疑菌株分別與ＡＰＰ １、３、５、７、９單因子標準陽性血清均勻混合，按照常規方法進行平板凝集試驗，觀察結果。

２結果

２．１細菌的形態特征

病料涂片以及分離純化菌革蘭氏染色、鏡檢，都可見有革蘭氏陰性、多形態的細菌，多為球桿菌、短桿菌、偶有成絲狀的細菌，著色不均。

２．２分離菌的培養特性

３株分離菌在加入2% ＮＡＤ的ＰＰＬＯ固體培養基上培養２４ ｈ，可見１～２ ｍｍ、露珠狀、半透明的菌落。

２．３CＡＭＰ試驗

３株分離菌在靠近金黃色葡萄球菌的地方出現明顯的溶血區域，即CＡＭＰ試驗陽性。

２．4生化試驗

３株分離菌均呈衛星現象，可水解尿素酶，發酵乳糖、果糖、葡糖糖，不發酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖及阿拉伯糖。靛基質、甲基紅、Ｖ－Ｐ試驗均為陰性。硝酸鹽還原試驗陽性，生長需要ＮＡＤ。

２．5血清型鑒定

ＴＺＡ１株、ＴＺＡ２株與ＡＰＰ １型陽性血清發生強烈的凝集發應，鑒定為血清１型；ＴＺＡ３株與ＡＰＰ ３型陽性血清發生強烈的凝集發應，鑒定為血清３型。３株菌株與生理鹽水和其他血清型的陽性血清未見凝集現象，結果見表１。

２．6藥敏試驗

ＴＺＡ１和ＴＺＡ２株對恩諾沙星和阿奇霉素極度敏感。ＴＺＡ３對頭孢唑肟極度敏感。３株分離菌對氟苯尼考、丁胺卡那霉素、強力霉素中度敏感，對復方新諾明和氨芐西林低敏，結果見表２。

３小結與討論

３．１ＡＰＰ分離

胸膜肺炎放線桿菌營養要求高且受外界影響因素較多，初次比較困難。在分離的過程中，對于病死豬最好在剛死亡或頻臨死亡時采集病料，否則，即使病料中有ＡＰＰ感染，也會因豬死亡時間長，致使病料中ＡＰＰ死亡［５］。應在初次分離培養的培養基中加入ＮＡＤ，否則APP在常規培養基中大多不生長或生長不良。本次分離選擇加入ＮＡＤ的ＰＰＬＯ瓊脂培養基，成功分離到了３株ＡＰＰ菌株。

３．２ＡＰＰ血清型鑒定

胸膜肺炎放線桿菌在不同國家和地區流行菌株的血清型有所不同［６］。研究表明，我國流行的豬傳染性胸膜放線桿菌血清型以１型、３型、７型為主［７］。因此，本試驗選用胸膜肺炎放線桿菌標準單因子陽性血清１、３、５、７、９型為鑒定標準，結果從泰州地區規模豬場分離到的３株ＡＰＰ菌株，血清分型試驗鑒定ＴＺＡ１和ＴＺＡ２為血清１型，ＴＺＡ３為血清３型。本次試驗基本摸清了泰州地區ＡＰＰ流行菌株的優勢血清型，為本地區豬場豬傳染性胸膜肺炎的免疫預防奠定了基礎。

３．3ＡＰＰ藥敏試驗

藥敏試驗結果表明，３株分離菌對同種藥物的敏感性有較大差異，其中ＴＺＡ１和ＴＺＡ２兩個分離株對恩諾沙星和阿奇霉素極度敏感，而ＴＺＡ３株對頭孢唑肟極度敏感。本藥敏試驗篩選出的恩諾沙星、阿奇霉素、頭孢唑肟和氟苯尼考可作為治療本地區PCP的首選藥物。研究表明，多種抗菌藥物對該菌的治療效果不理想［４］。獸醫臨床上常選用的氟苯尼考和強力霉素等藥物敏感性不高，究其原因可能是這些抗生素的大劑量、不規范使用導致臨床上耐藥性的產生。建議規模化豬場在防治PCP時最好通過藥敏試驗選用敏感度較高的抗生素，以最少的投入獲得較大的經濟效益。

參考文獻：

［１］ 唐文山，李昕．豬傳染性胸膜肺炎研究進展［Ｊ］． 動物醫學進展，２００８，２９（２）：９８－１０２．

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［３］ 馬曉平，彭廣能，曹三杰，等．豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的初步分離鑒定與診治體會［Ｊ］．中國獸醫雜志，２００８，４４（２）：７５－７６．

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［５］ 雷連成，華芳，王麗哲，等．豬胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定與毒力測定［Ｊ］．中國獸醫學報，２００８，２８（４）：3５９－３６２．

［６］ 冼瓊珍，黃耿森，葉潤全，等．血清６型豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離與鑒定［Ｊ］．黑龍江畜牧獸醫，２００７（５）：７０－７２．

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［８］ 余光勇，郭萬柱，徐志文，等．一株四川株豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定［Ｊ］．黑龍江畜牧獸醫，２００８（6）：６２－６４．