藥渣纖維素降解菌的篩選及酶活測定

郭建軍等

摘要：以藥渣和羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源，通過平板初篩及多種酶活綜合測定復篩，從深層封土、牛糞堆肥等樣品中篩選到８株纖維素降解菌，其中菌株ＪＸ９的酶活最高，酶系組成最合理，其Ｃｘ、Ｃｂ、Ｃ１和ＦＰＡ分別達到８２．４１、5.71、15.52和7.64 Ｕ／ｍＬ。

關鍵詞：藥渣；纖維素降解菌；篩選；纖維素酶

中圖分類號：Ｑ９３－３３１；Ｑ９４６．５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0689-03

江西省現有中成藥生產企業近百家，這些企業每年產生近１００萬ｔ廢棄中藥渣，而全國每年產生１ ０００多萬ｔ中藥殘渣［１］。藥渣造成大量環境污染的同時也增加了企業處理這些藥渣的經濟負擔，如何有效處理這些藥渣的問題已日益突出［２］。藥渣主要組分包括纖維素、半纖維素和木質素，其中纖維素是制約藥渣降解的重要因素。使用傳統的物理化學方法，如酸處理、堿處理以及蒸汽加熱等方法處理藥渣等，存在反應條件劇烈、設備昂貴、成本較高、帶來新的環境污染等問題［１－３］。而利用投加纖維素高效降解菌的方法經濟、有效，正逐漸成為當前的研究熱點［４］。近年來，國內外對于纖維素降解菌和纖維素酶的報道較多，但大部分研究集中在對秸稈的降解上，對于藥渣降解的報道甚少。本研究的目的就是利用以纖維素為惟一碳源的方法從堆肥中初步篩選高效無毒的好氧纖維素降解菌，再從中復篩出較好的菌株，以便開發藥渣好氧堆肥的高效微生物菌劑。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１含菌樣品２００９年１０月中旬，采集森林中腐化的楠木、長期堆放而腐化的松木以及腐爛的植物下表層濕潤肥沃的土壤，采集長期堆放藥渣被污染的表層肥沃的土壤以及深層封土、牛糞堆肥等共１０份樣品。這１０份樣品包括植物樣品４份、土壤樣品６份。采集樣品后立即帶回實驗室接種，進行富集培養。

１．１．２培養基［５］富集培養基：Ｋ２ＨＰＯ４ ２．０ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．３ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５．０ ｍｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ １．６ ｍｇ，ＺｎＳＯ４ １．７ ｍｇ，ＣｏＣｌ２ ２．０ ｍｇ，藥渣粉３０ ｇ，用去離子水定容至１ Ｌ。羧甲基纖維素鈉（ＣＭＣ-Na）固體培養基：ＣＭＣ－Ｎａ １５．０ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ，瓊脂２０ ｇ，用去離子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃滅菌。纖維素－剛果紅固體培養基：ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ ｇ，瓊脂２０ ｇ，剛果紅０．２ ｇ，ＣＭＣ－Ｎａ ２０ ｇ，ＮａＣｌ ０．５ ｇ，用去離子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１℃滅菌。液體產酶培養基：ＣＭＣ－Ｎａ或者藥渣２６ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，蛋白胨１ ｇ，酵母膏１ ｇ，ｐＨ ７．０～７．５，１２１ ℃滅菌。

１．２方法

１．２．１菌種富集稱取菌種來源樣品５ ｇ，加入以藥渣為惟一碳源的１００ ｍＬ富集培養基中，２８ ℃恒溫振蕩培養７ ｄ，吸取５ ｍＬ培養液轉入新的富集培養基，富集３代。

１．２．２菌種初篩取富集３代的培養液適當稀釋，在纖維素-剛果紅固體培養基上分離純化菌種，觀察平皿上是否出現水解環以及水解環的大小。同時參考水解環產生的先后和清晰度，初步比較不同菌株的纖維素酶酶活，并確定用于酶活測定的菌株。

１．２．３菌種復篩將分離得到的優勢菌株分別接入液體產酶培養基，３７ ℃振蕩培養４ ｄ，將發酵液用2層紗布過濾，濾液于４ ℃，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，上清液即為粗酶液。

１．２．４酶活測定［６，７］采用ＤＮＳ還原糖法測定各纖維素酶酶活。全酶活（ＦＰＡ）的測定：取2支２５ ｍＬ刻度的試管，各加０．２ ｍＬ酶液，再加ｐＨ ４．８的醋酸緩沖液１．８ ｍＬ。測定管加入１ ｃｍ × ６ ｃｍ濾紙條，充分浸泡于（５０.0±０．５）℃恒溫水浴６０ ｍｉｎ，空白管同時置（５０.0±０．５）℃恒溫水浴６０ ｍｉｎ。然后分別加入ＤＮＳ顯色液２ ｍＬ，空白管同時加１ ｃｍ × ６ ｃｍ濾紙條。沸水浴１０ ｍｉｎ，冷卻后加水至１５ ｍＬ，以空白管調零點，在５５０ ｎｍ處測ＯＤ值。內切酶酶活（Ｃｘ）的測定：取2支２５ ｍＬ刻度的試管，各加０．２ ｍＬ酶液。測定管加１．８ ｍＬ ＣＭＣ-Na（質量分數１％），空白管只加ｐＨ ４．８的醋酸緩沖液１．８ ｍＬ。然后置（５０.0±０．５）℃恒溫水浴６０ ｍｉｎ。再分別加入ＤＮＳ顯色液２ ｍＬ。放沸水浴鍋反應１０ ｍｉｎ，冷卻后加水至１５ ｍＬ，以空白管調零點，在５５０ ｎｍ處測ＯＤ值。外切酶酶活（Ｃ１）測定則只用把ＦＰＡ測定中的濾紙條換成５０ ｍｇ的脫脂棉，β－葡萄糖苷酶酶活（Ｃｂ）測定需把Ｃｘ測定中的ＣＭＣ-Na（質量分數１％）換成水楊素（質量分數１％）。

２結果與分析

２．１菌種初篩結果

將來自于堆放的腐化朽木、腐爛植物及腐爛藥渣的肥沃土壤及深層封土等作樣品，在以藥渣為惟一碳源的培養基中進行３代富集，取其菌液涂布于ＣＭＣ-Na固體培養基中，待其長出菌落后，進行平板劃線法分離，分離到一系列纖維素降解菌。然后將分離得到的纖維素降解菌分別接種在纖維素－剛果紅固體培養基上觀察其生長情況。纖維素降解菌能快速地在纖維素－剛果紅固體培養基上產生清亮的水解環，試驗表明，其中JX8和ＪＸ９菌株在平板上能較快地產生較大的水解環，圖１是ＪＸ８和ＪＸ９在培養基上的水解環，說明它們具有較高的纖維素酶酶活。

２．２菌種復篩結果

纖維素的降解是多酶體系作用的結果，多酶體系包括內切β-1，4葡萄糖苷酶（Ｃｘ酶）、外切β-1，4葡萄糖苷酶（Ｃ１酶）、β－糖苷酶（Ｃｂ酶）３種主要成分。為此選擇測定Ｃｘ、Ｃ１、Ｃｂ、ＦＰＡ ４種酶活大小作為菌種的復篩依據。

將菌種分別接入以藥渣和ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的液體產酶培養基，培養５ ｄ后的酶活測定結果如表１所示。通過對以藥渣和ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的兩種發酵方式進行酶活測定，篩選得到了８株酶系組成各異的菌株。由試驗結果可以看出，對于FPA和Ｃｘ，以藥渣為碳源的菌ＪＸ９和以ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的菌ＪＸ８的較高，且它們的Ｃｘ與其他菌相比差異較大；對于Ｃ１，以藥渣為碳源的菌ＳＣ１和以ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的菌ＳＣ３的較高；Ｃｂ相對于其他酶活都較低；Ｃ１、Ｃｂ和FPA在菌株之間差異都較小；這些表明菌株ＪＸ８和ＪＸ９降解纖維素的能力比其他菌株要強；酶活測定結果與水解環測定結果基本吻合，進一步驗證了用纖維素－剛果紅固體培養基平板篩選纖維素降解菌的方法是比較合理可行的。

２．３纖維素降解菌產酶的酶活穩定性測定結果

由上述試驗可以看出，菌株ＪＸ８和ＪＸ９的酶活相對較高，說明其分解藥渣、ＣＭＣ－Ｎａ的能力比其他菌株要強，因此，選擇以藥渣為碳源的ＪＸ９菌株和以ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的ＪＸ８菌株的發酵液為試驗樣。在２０～１００ ℃的不同溫度下測定其Ｃｘ，如圖２所示，兩菌株產酶的酶活具有較好的耐高溫活性，但菌株ＪＸ９的Ｃｘ一直高于ＪＸ8；圖３結果表明，ＪＸ９菌株發酵產酶的酶活在ｐＨ ４～９時都保持較高的活性，相對ＪＸ8更穩定，說明其發酵后產生的酶活具有較好的廣譜性，該試驗說明菌株JX9相對JX8酶活更高且酶系組成更合理。

３結論與討論

為了獲得盡可能多的優良降解菌，一般采用多種方法對纖維素降解菌進行篩選。本試驗采用傳統纖維素－剛果紅培養基平板法進行初篩和多種纖維素酶活綜合測定進行復篩相結合，以防止遺漏優良菌種［８］。篩選得到了８株酶活較高且酶系組成比較合理的菌種，其中ＪＸ９菌的酶活最好，酶系組成也最合理，對其以藥渣為碳源的發酵，FPA達7.64 Ｕ／ｍＬ，Ｃx、Ｃｂ和Ｃ１分別為82.41、5.71和15.52 Ｕ／ｍＬ，且其酶活穩定性相對較高，說明了纖維素的降解是多酶體系協同作用的結果，以多種酶指標進行纖維素降解菌的篩選是一種更為有效的篩選方法。

纖維素的生物降解過程涉及到一組復合的纖維素酶，一般認為它包括３種，分別為內切β－１，４葡萄糖苷酶，簡稱內切酶；外切β－１，４葡萄糖苷酶，簡稱外切酶；β－糖苷酶，也稱纖維二糖酶。纖維素的降解必須依靠３種組分的協同作用才能完成［９］。本試驗結果表明，菌株ＪＸ９內切酶酶活高，且穩定性較好，但Ｃ1不如Ｃｘ好。研究表明，內切酶對聚合度高的長鏈纖維素水解能力強，而β－糖苷酶對短鏈纖維素類物質如纖維二糖具有很強的水解能力［１０，１１］，Ｃb過低會導致中間產物纖維二糖積累從而阻遏或抑制整個纖維素降解過程［１２，１３］。因此今后的工作中，可篩選Ｃb較高的菌株與ＪＸ９混合發酵，進一步提高ＪＸ９降解纖維素的效率。

今后可以結合藥渣降解，進一步加強微生物參與利用纖維素降解生產，這對緩解能源危機及環境污染等問題也具有深遠的影響。近年來許多學者認為，纖維素的高效降解與微生物之間的協同作用有一定相關性，這些協同作用包括纖維素降解菌間、纖維素和非纖維素降解菌間的相互作用。張曉昱等［１４］研究發現把真菌與細菌共培養后，其降解纖維素的速率明顯高于任何一個單一菌株。但是由于菌種的產酶能力以及酶組分比例協調問題，在纖維素高效降解過程中，多種微生物之間的協同降解仍有待進一步研究。