硫酸化茯苓多糖的研究進展

李偉 羅榮珺

茯苓(Poria cocos)是我國傳統的名貴中藥材,主產云南(云苓)、安徽(安苓)、貴州、廣西、湖北、福建(閩苓)等地,為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核,屬擔子菌綱真菌,具有滲濕、健脾、利尿等功能。茯苓多糖為我國傳統中藥茯苓的主要有效成分,可用于醫療、保健等領域,具有廣闊的開發應用前景。為進一步優化茯苓多糖的提取工藝,促進其開發應用,文章參考大量國內外文獻,對近幾年茯苓多糖的提取、純化及其應用作一綜述。

1茯苓多糖的化學組分

眾多文獻報導β-D-(1-3,1-6)葡聚糖有顯著的調理或增強人體免疫功能,但由于高分子量和復雜的高級分子結構,一些多糖的水溶性很差,只有對這些多糖進行結構修飾和改造才可以更好地利用它們。Chihara等[1]通過Smith降解除去β-1,6分支,將β-茯苓聚糖轉化成β-茯苓多糖(Pachymaran),對實體瘤S180的抑瘤率從0提高到88％。Hamuro等[2]采用液固相振蕩半合成工藝,制取了羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran,CMP),水溶性得到很大改善,動物試驗的結果表明,CMP抗腫瘤作用較強。將天然多糖進行硫酸酯化修飾也是多糖結構改造的一個研究熱點,多糖硫酸化后可以增強原有的生物活性或產生新的功能。

2茯苓多糖的提取及純化

茯苓多糖主要存在于茯苓細胞壁中,按照溶解度的不同又分為水溶性茯苓多糖和堿溶性茯苓多糖。通常采用水提醇沉法、堿提醇沉法提取。

2.1 水提醇沉法

稱取20g茯苓粉末→10～20倍熱水(95℃)浸提→抽濾→濾液減壓濃縮(浸提液∶濃縮液=10∶1)→4倍體積的95%乙醇沉淀(含醇量達80%)→于冰箱中靜置過夜→離心→沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→真空干燥得茯苓多糖粗品。該法采用水作為溶劑,具有價廉、無毒、操作安全等優點,其缺點是浸提時間長且提取率較低。

2.2 稀堿浸提法

稀堿法浸提堿溶性茯苓多糖應注意,在提取結束后應迅速用醋酸中和,以免多糖活性受影響。稱取20g茯苓粉,分3次溶于總共為10倍體積的0.5MNaOH中,每次4℃浸提多糖8h,合并3次浸提上清液,10％醋酸中和至pH6～7,4℃冰箱中沉淀過夜。低溫離心收集沉淀,去離子水洗滌沉淀3次,無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌,70℃干燥得白色茯苓多糖,研成粉末待用。

該法提取率較水提醇沉法高,但浸提程序較繁瑣,浸提條件較劇烈,極易破壞多糖的立體結構,使其生物活性受到限制。

2.3 茯苓多糖的純化

將DEAE-650C層析柱水平衡后,取200mg精制多糖樣品溶解于蒸餾水中上樣, 蒸餾水洗脫60mL后,以0～3mol·L-1NaCl溶液梯度洗脫,流速1·0mL·min-1,每管收集2mL,分布收集、備用。然后用硫酸-苯酚法檢測多糖含量,具體操作如下。

硫酸-苯酚顯色液的配制:用50mL濃硫酸和10mL水配制實驗用硫酸溶液,并加入0.6g苯酚,配制成顯色液。

顯色方法:移取1.00mL待測樣品于試管中,加入5.00mL顯色液,振蕩混勻。置于沸水浴中保溫30min,立即置于冷水浴中, 冷卻至室溫。以未加葡萄糖溶液作為空白對照。于490nm處測定系列葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。測定樣品溶液490nm 處吸光度,據標準曲線計算多糖含量。

3硫酸化多糖的生物活性研究

硫酸化多糖具有獨特的生物活性,主要表現在抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等方面。

3.1 硫酸化多糖的抗病毒活性

抗病毒活性是硫酸化多糖最顯著的活性,許多經硫酸酯化的多糖,如香菇多糖、地衣多糖、右旋糖桿、裂褶菌多糖、木聚糖、箬葉多糖的硫酸酯有明顯的抑制HIV-1(Human Immune Efficiency Virus Type1)活性,其作用機理是干擾HIV-1對宿主細胞的粘附作用,抑制逆轉錄酶的活性等。抗病毒硫酸酯化多糖的硫酸根取代度在1.5～2.0為最佳,如果將這些多糖的硫酸根除去,則上述活性隨之消失。

Nakashima等人從海洋紅藻Schizymenia pacifica分離到一種分子量大約為2×106Da的硫酸化多糖,含73%的半乳糖,20%的硫酸基,紅外光譜和水解產物的分析表明這是一種γ-角叉菜膠。體外實驗表明,該復合物能顯著抑制逆轉錄酶的活性,在2×103 抑制單位/mL的濃度下可抑制92%的反轉錄酶活性。該抑制活性是特異性的,對正常細胞的生長沒有影響。

3.2 硫酸化多糖的抗凝血和抗血栓活性

肝素和低分子肝素是硫酸化多糖抗凝血活性的代表,目前已經廣泛應用于臨床實踐。低分子肝素是商品肝素降解的衍生物,平均分子量為4～8kD,糖基數13～22個。現在已知,肝素抗凝作用主要是靠與ATⅢ和凝血因子Ⅱa形成三元復合物,使ATⅢ能有效滅活凝血酶。肝素的作用一方面有賴于分子中大量的負電荷,另外,其松散的構象有利于與蛋白質或細胞表面位點匹配結合。肝素可與許多血漿蛋白、血小板及血管壁基質蛋白結合。如果采用化學方法去除其分子上的硫酸基團,則其體外抗凝作用降至2%以下。

對褐藻多糖硫酸酯的活性研究表明,其各組分均具有抗血小板活化因子的作用,其效應與濃度稱正比,與硫酸根的含量也有正比關系。Alban等用硫酸化Curdlan的產物CurS進行抗凝血實驗,發現CurS抗凝血模式不同于肝素。CurS通過抑制FXa的形成而減少凝血酶的產生,加速HCII(heparin cofactor II)介導的凝血酶的失活,阻止凝血酶介導的纖維蛋白多聚物的形成,而它的AT介導的抗凝血酶活性要比肝素低得多。Buchanan硫酸化硫酸皮膚素空間特異位點獲得低分子量、高溶解度的產物Intimatan,實驗證明是HCII的有效激動劑,其抗凝和抗血栓效果優于硫酸皮膚素和肝素。Mourao等從棘皮動物海黃瓜中分離出一種硫酸化多糖(Fucosylated chondroitin sulfate),和哺乳動物的硫酸軟骨素有一樣的骨架結構,但一些葡萄糖醛酸殘基上有硫酸化的巖藻糖分支。正是這種分支賦予該多糖高抗凝活性。這種多糖的抗凝活性和抗凝機制均不同于具有相似取代度的肝素和硫酸化的巖藻聚糖,這種差異來自于多糖空間結構的差異。

3.3 硫酸化多糖的抗腫瘤活性

利用海藻多糖硫酸酯進行的抗癌實驗顯示,海藻多糖硫酸酯能抑制小鼠體內Lewis肺癌的生長,抑瘤率可達65.41%以上;體外能抑制A549肺癌細胞的生長,抑制率大于55.56%;流式細胞儀檢測到典型的細胞凋亡峰。

從海藻中提取得到的硫酸化多糖如聚古羅糖酯(912),平均相對分子量為6kD。體內實驗結果表明,912能顯著抑制小鼠體內S180肉瘤的生長;體外實驗結果表明912對ts-FT210(溫度敏感型大鼠乳腺癌細胞)增殖的抑制作用能達到63.69%以上。由于912對正常細胞及其他大多數腫瘤細胞均無明顯的抑制作用,說明其具體的作用機理是通過細胞周期和蛋白抑制發揮作用,而傳統的細胞毒藥物是通過誘導凋亡機制發揮作用。這與一般的多糖通過增強機體免疫功能而發揮抗腫瘤活性也不相同。

體外實驗表明,在樣品濃度為2.5mg/kg時,硫酸化茯苓多糖對肺癌細胞的抑制率為16.2%,與順鉑合用,能顯著降低順鉑對肺癌細胞的IC50值。從灰樹花發酵菌絲體分離獲得的水不溶性多糖經硫酸化后得到的灰樹花硫酸酯,在體外對S180無抑制活性,但對人胃癌細胞SGC-7901有直接殺傷作用。

硫酸化多糖抗腫瘤的途徑既有較為普遍的增強機體免疫功能,也有通過對細胞周期和特異蛋白表達的抑制及抑制腫瘤誘導的血管生成。

3.4 硫酸化多糖的抗動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化的發生、發展是一個十分復雜的病理過程,它涉及到血管內皮細胞、平滑肌細胞、炎性細胞(如單核細胞、巨噬細胞)、淋巴細胞、血小板等多種細胞及相關因子。許多研究發現硫酸化多糖與動脈粥樣硬化存在密切的關系。大多報道表明硫酸化多糖可保護血管內皮細胞免受各種刺激因子的損傷作用,從而阻斷動脈粥樣硬化形成的起始環節;另外,硫酸化多糖也可以通過抑制血管內皮細胞的增殖、遷移,減少炎性細胞、淋巴細胞、血小板等黏附、聚集到血管內膜,抑制補體的激活等多種途徑來達到抗動脈粥樣硬化的目的。

4前景展望

相信隨著多糖研究方法的不斷改進和多糖制藥工藝的進一步提高,隨著多糖分離、提純、糖合成化學以及糖生物學、醫學研究的不斷深入,多糖硫酸化技術必將得到進一步改善,茯苓多糖將會具有更加廣闊的市場。

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