鐵皮石斛組織培養的工藝條件研究

田思源

1鐵皮石斛的概述及其藥用價值

鐵皮石斛,為石斛屬珍稀瀕危藥用植物,俗稱鐵皮楓斗,又稱黑節草,屬于蘭科附生蘭類,是一種珍稀的藥用植物和和名貴的室內觀賞植物。野生的鐵皮石斛大多分布在東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區。在我國主要分布于秦嶺、淮河以南的云南、廣西、貴州、浙江等地的山區[1]。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳,自然條件下需要與某些真菌共生才能萌發,很難用實生苗栽培;而傳統的分株、扦插等方式的繁殖率極低,加上人為的過度采挖和破壞生境,其資源已瀕臨滅絕,被國家列為重點保護的藥用植物之一。鑒于鐵皮石斛在我國栽培的地域局限性,規?；_發石斛活性物質急需要開辟新的途徑。而鐵皮石斛組培以其繁殖規模大、速度快為優勢是生產有效物質的一種有前途的途徑和手段,是解決其資源緊缺問題的有效途徑。因此對鐵皮石斛組織培養及其工藝條件的深入研究就具有了非常重要的意義,它不僅具有顯著的經濟效益和社會效益,同時也具有顯著的生態效益。

2多種條件對鐵皮石斛組織培養的影響

2.1 不同添加物對鐵皮石斛外植體的影響

香蕉、蘋果、椰子等水果中含有多種天然植物激素及豐富的無機鹽離子,對鐵皮石斛幼芽增殖有明顯的促進作用。在組織培養中添加香蕉泥、蘋果汁、椰子汁可以豐富石斛快繁時所需要的多種激素。從實驗數據中得出香蕉泥效果最好。劉驊[2]等研究表明,基本培養基以B5或1/2MS,選用10％的香蕉水提物,NAA 2mg/L是鐵皮石斛試管苗壯苗的適宜培養基。馬治國等對鐵皮石斛原球莖分化適宜培養基研究也得出相似結論。

2.2 不同溫度對鐵皮石斛外植體生長的影響

不同溫度對鐵皮石斛外植體的生長有十分明顯的影響。在溫度為25℃比20℃、30℃和35℃更有利于外植體的出芽率和生長勢的提高。20℃時,石斛出芽率也是較高的。但是30℃之后,出芽率急劇下降,35℃時石斛出芽受到完全抑制,出芽率為零。探究原因,是因為過高的溫度破壞了石斛細胞的代謝體系。更準確地說,高溫破壞了代謝體系中各種各樣的酶及其一些活性物質,使得代謝無法正常進行,使得鐵皮石斛外植體長勢欠佳或者根本不出芽。因而培養石斛外植體時,溫度的選擇非常重要。

2.3 不同pH對石斛外植體生長的影響

不同pH對石斛外植體的生長也有明顯的影響。在pH為5.8的培養基中,外植體出芽率最高,pH5.5次之,pH6.4出芽率最小。在pH為5.8比5.2、5.5和6.1更有利于外植體的出芽率和生長勢的提高。

2.4 不同的激素配比對石斛外植體生長的影響

物激素是植物組織培養中不可缺少的成分,適量的加入適宜的植物激素的種類和濃度,是誘導培養物發生一定的生理變化和形態變化的最主要的因素。前人研究結果表明,激素配比對于鐵皮石斛原球莖的誘導、增殖、分化及生根壯苗均有重要的影響。生長素和細胞分裂素相互配合能調節細胞的分裂與分化,控制器官的分化,生長素高時可誘導根的形成,細胞分裂素高時可促進芽的分化。當IAA0.1mg/ml,6-BA0.5mg/ml各兩滴時,石斛出芽率最高,長勢最佳。IAA、6-BA濃度過大時,石斛生長會受到抑制,出芽率很低。

2.5 不同的香蕉泥添加量對石斛外植體生長的影響

在第一個影響條件中比較了不同有機添加物對石斛組織培養的影響,并得出香蕉泥是最佳的添加物的結論。為了更進一步提高鐵皮石斛外植體的出芽率,我們研究了香蕉泥的最佳添加質量。從實驗中得出,每毫升培養基中添加150g香蕉泥更有利于外植體的出芽率和生長勢的提高。添加的香蕉泥的量在100g～200g范圍內都有較高的出芽率,而繼續增大香蕉泥添加量,不能夠提高出芽率,反而使得出芽率下降。培養鐵皮石斛外植體時應注意確定添加物的添加量,對培養條件進行優化,以達到最佳培養條件。

3 組培苗的移栽

石斛外植體在增殖培養基中培養,一段時間后,選取生長狀況一致的幼芽接種到生根培養基上,將幼苗分瓶于生根瓶中;當組培苗生長到4cm或更長時,打開培養瓶蓋置于自然光下煉苗3d。然后取出生根苗,小心洗去基部培養基,用0.1%滅菌靈消毒,以防栽培后的石斛根腐爛。將幼苗栽種于分裝著椰糠、干苔蘚的基質中,遮蔭環境下,每天潔水噴霧保濕1次,以防幼根干燥。10d后看到有新葉生長和莖節明顯變粗,生長40d后,獲得了十分健壯的快繁幼苗。若不及時移栽,使得石斛苗長期在培養瓶中生長,會因營養耗盡而枯黃甚至死亡。

4組培苗移栽

當組培苗移栽到基質上,盡量選取比較透氣的材料。據此,可適當選取粗纖維類的椰糠和干苔蘚作為基質[3]。但考慮到苗小、根少,如基質間隙太大不利于鐵皮石斛糼苗固定和吸收水肥,可用干苔蘚包裹住生根小苗栽種,遮蔭環境下,每天潔水噴霧保濕1次,既可肥水又不影響透氣,適合石斛的生長習性,利于快速育苗,促進壯根生長。移栽后,植株成活率達90%以上,為后續進一步移栽地面做好了前期準備。

綜上所述:當培養基是1/2 MS固體培養基;采用激素0.1mg/mL IAA、0.5mg/mL 6-BA;溫度為25°C;pH為5.8;添加物為香蕉泥,其濃度為150g/L;石斛外植體的出芽率和生長勢最高,染菌和褐變的幾率也最低,外植體生長情況最佳。

參考文獻

[1] 邵華,張玲琪,李俊梅.鐵皮石斛研究進展.中草藥,2004,35(1):109～111

[2] 劉驊,張治國,趙立紅,等.迭鞘石斛的種子萌發和試管苗形成[J].現代應用藥學,1989,6(5):8～9．

[3] 陳瑞蕊,林先貴,施亞琴.藥用石斛及其組織培養技術研究概要[J].江蘇農業科學,2002,(5):65～66．