有關(guān)“單克隆抗體制備”的幾點釋疑

李穎

摘要：“單克隆抗體的制備”是高中生物選修三的一個難點。筆者通過深挖教材，對教材中沒有解釋清楚的幾個疑點做了闡釋，同時構(gòu)建了邏輯更為合理的單克隆抗體流程圖供大家參考。

關(guān)鍵詞：單克隆抗體；雜交瘤細胞；選擇性培養(yǎng)基

中圖分類號：G633.91 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2012）09-0204-02

“單克隆抗體的制備”是高中生物人教版選修3專題2第二節(jié)“動物細胞工程”一節(jié)的重點和難點。內(nèi)容相對復雜、抽象，加上教材對部分環(huán)節(jié)處理得很簡練，學生理解起來難度很大，難免產(chǎn)生這樣或那樣的疑問。筆者通過對教材的研究及教學的反思，將教學過程中學生提出的問題及課本中應(yīng)挖掘和拓展的知識總結(jié)如下：

1 教材中需要挖掘和總結(jié)的知識

1.1什么是單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體（monoclonal antibody）：是指利用一個B淋巴細胞進行無性增殖，產(chǎn)生大量的同一種類的B淋巴細胞群，再由這個細胞群產(chǎn)生出化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。多克隆抗體（polyclonal antibody）：當肌體受到抗原刺激后，可產(chǎn)生新的抗體?？乖肿拥臎Q定簇直接決定了抗體的特異性的存在，同時也內(nèi)含著大量的原決定簇。所以，經(jīng)過他免疫所纏身的抗血清實就是多種抗體的混合物，我們習慣性地把這個稱為克隆抗體。

1.2單克隆抗體制備的原理是什么。動物在免疫反應(yīng)的過程中，各種B淋巴細胞都可以分泌出特有的特異性抗體，為了大量地獲得，就必須最大限度地增加增殖這些單一抗體。而且眾所周知，B淋巴細胞可以產(chǎn)生一種能力，叫做單一抗體，但是他的局限是不能夠完成體外增殖；但是骨髓瘤細胞卻可以在外界限定條件下被無限地增殖，更為可怕的是它是癌細胞，還好沒有產(chǎn)生抗體的能力。所以大膽試驗，把二者合為一體進行細胞融合，產(chǎn)生新細胞，這種細胞兼具雙特性——在特定條件下，可以產(chǎn)生大量某種特異抗體，卻不會出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。

1.3從小鼠脾臟中獲取的B淋巴細胞是指哪類細胞？是否是一種淋巴細胞？從小鼠脾臟中取出的能產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞指的是漿細胞（效應(yīng)B細胞）。但是在在免疫的實際操作中，我們采用的方法是連續(xù)注射抗原，由于每一次注射的抗原不同，而一種抗原特定簇只能形成相對應(yīng)的一種B淋巴細胞。所以，提取的B淋巴細胞也有著各不相同的特異性。

1.4B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后獲得哪些類型細胞。在制備雜交瘤細胞這一步驟中，培養(yǎng)液中共含5種主要細胞，即未融合的B淋巴細胞、未融合的骨髓瘤細胞、B淋巴細胞-B淋巴細胞融合細胞、骨髓瘤-骨髓瘤融合細胞和B淋巴細胞-骨髓瘤細胞融合細胞（雜交瘤細胞）。

2 教材中相關(guān)知識的拓展

2.1如何利用特定的選擇性培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞。第一次篩選的關(guān)鍵在于細胞融合后，如何選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞。我們有兩種方法可以合成細胞中的DNA。第一條途徑“D途徑”，也就是用氨基蝶呤來直接阻斷DNA的合成的一種極端方法。第二條途徑適合使用在緊急情況下，也被叫做“S途徑”。也正是以此為根據(jù)，我們在配置HAT選擇性培養(yǎng)液的時候會定量放入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。這其中的未融合的B淋巴細胞和兩個B淋巴細胞融合的“D途徑”氨基蝶呤阻斷，導致其短期死亡。就算“S途徑”正常，也因其缺乏體外培養(yǎng)增殖的能力而死亡。再說骨髓瘤細胞及其自身的融合細胞，屬于HGPRT細胞，自身沒有“S途徑”，同時“D途徑”又被阻斷，導致HAT在培養(yǎng)液中迅速死亡。只剩下雜交瘤細胞，在擁有“S途徑”的同時，也可以在培養(yǎng)液中長期增殖，所以能選擇存活下來然后不斷增殖并不稀奇。

2.2雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)過程解析。雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng)就是：在融合后的細胞經(jīng)過選擇性培養(yǎng)后，那些能夠存活下來的細胞就是雜交瘤細胞。然后用“有限稀釋法”來選擇出這些雜交瘤細胞是否是能分泌出所需抗體的類型。接下來就是培養(yǎng)過程，先將雜交瘤細胞稀釋，嚴格限制每空細胞不能超過一個，用多孔細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，并觀察其不斷地增殖。過一段時間觀察是否出現(xiàn)陽性孔，陽性孔是各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔。由于陽性孔自身的特性所限，必須進行3到4次的有限稀釋才能夠保證每個培養(yǎng)孔的增殖的細胞為單克隆細胞。至此，克隆化培養(yǎng)才算結(jié)束。

2.3為什么獲得預定的雜交瘤細胞后，要盡快進行單克隆抗體制備。實驗中，融合細胞會隨著培養(yǎng)時間延長發(fā)生污染、染色體丟失以及細胞死亡率增加等現(xiàn)象，因此，一旦獲得能產(chǎn)生預定特異性抗體的雜交瘤細胞株，就應(yīng)盡早地進行單克隆抗體制備。

2.4單克隆抗體獲取的途徑是什么。大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法可分為體內(nèi)和體外兩大類，目前以體內(nèi)法為主。

體外培養(yǎng)法：將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞合成并分泌單克隆抗體，收集上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。

體內(nèi)培養(yǎng)法：往小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細胞，雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。用注射器抽取腹水，提取單克隆抗體。

2.5獲得的單克隆抗體為什么還要進一步純化。無論是體內(nèi)還是體外培養(yǎng)獲得的單克隆抗體都必須進一步純化，因為單克隆抗體上仍有可能帶有鼠的抗原決定簇，患者有可能產(chǎn)生針對于單克隆抗體的抗體，出現(xiàn)交叉反應(yīng)。單抗純化有三種比較常見技術(shù)：1.DEAE離子交換層析柱；2.凝膠過濾法；3.親和層析法。我們應(yīng)該根據(jù)實驗中的實際情況來選擇合適的方法，而不是按照課本，一步步照搬而來。

為了方便讀者更好地理解文中的內(nèi)容，筆者繪制了單克隆抗體的制備流程圖，僅供參考。

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