酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測基礎免疫兒童破傷風抗體水平

羅 君，朱路平，李東麗

破傷風是由破傷風桿菌 (clostridium tetani)侵入傷口生長繁殖產生毒素而引起的一種急性特異性感染。破傷風可在任何年齡發(fā)病，病死率高。為了解0～7歲兒童破傷風疫苗全程足量免疫后抗體水平，本研究收集了鄭州市262份0～7歲基礎免疫兒童血清樣品，用國內和國外兩種酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)試劑盒進行破傷風IgG抗體定量檢測，并且評價破傷風IgG ELISA試劑的檢測效率和可靠性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2010年8月—2011年3月鄭州大學第三附屬醫(yī)院0～7歲基礎免疫兒童血清樣本262份，其中男140份，女122份。檢測前所有標本－20℃保存。

1.2 樣本采集

1.2.1 免疫程序 根據我國2005年《預防接種工作規(guī)范》中規(guī)定［1］，百白破疫苗為國家免疫規(guī)劃中基礎免疫疫苗，常規(guī)免疫程序為百白破疫苗接種5劑次，前3劑次為基礎免疫，第4劑次為加強免疫，第5劑次使用疫苗加強免疫1劑次。新生兒出生后3個月開始接種百白破疫苗第1針，連續(xù)接種3針，每針間隔時間最短不得少于28 d，在1歲半至2周歲時再用百白破疫苗加強免疫1針，7周歲時用精制白喉疫苗或精制白破二聯(lián)疫苗加強免疫1針。

1.2.2 樣本采集 262份血清樣本抽樣采集于鄭州大學第三附屬醫(yī)院的基礎免疫兒童，包括未接種疫苗的新生兒樣本，及接種疫苗后不同年齡段樣本，抽取的樣本待自然凝固后高速離心，取上層血清于1.5 ml試管中冷凍備檢，并編號。

1.3 檢測試劑 使用兩種檢測試劑盒，分別是鄭州市安圖綠科生物工程有限公司生產的破傷風毒素IgG抗體定量檢測試劑盒 (批號:20101001，簡稱“安圖試劑”)和德國MPBiomedicals Germany GmbH生產的獲得CE注冊的破傷風類毒素IgG抗體檢測試劑盒 (批號:TT－204，簡稱“MP試劑”)。

1.4 檢測方法 ELISA間接法檢測。將血清1∶100稀釋后加入包被有破傷風類毒素的96孔酶標反應板，按照操作程序顯色后450 nm下讀取吸光度 (A)值。使用定量試劑盒提供的含量為0.1、0.2、0.4、0.8和2.0 U/ml的標準血清繪制標準曲線或計算標準回歸方程，根據樣品A值計算出IgG抗體含量(U/ml);同時以0.1 U/ml標準血清對應的A值為臨界值(Cutoff)，確定IgG抗體的陰性或陽性。262份兒童血清樣本用兩種試劑盒進行平行檢測，試驗中加樣試劑和洗板步驟分別由固定2人分工完成，試驗過程嚴格按試劑盒推薦步驟操作。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基礎免疫兒童血清破傷風IgG抗體水平 262份樣本中，“MP試劑”檢出結果IgG抗體陽性154份，陽性率為58.78%;“安圖試劑”檢出結果IgG抗體陽性146份，陽性率為55.73%。兩種試劑盒的檢測陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=1.45，P=0.227，見表1)。

表1 兒童血清破傷風IgG抗體水平Table 1 Tetanus antibodies level of children with fundamental immunity

2.2 不同年齡段兒童血清破傷風IgG抗體水平 兩種試劑盒檢測的不同年齡段兒童血清破傷風IgG抗體水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表2)。且不同年齡段的基礎免疫兒童的破傷風保護率達到了《計劃免疫管理規(guī)程》的相關規(guī)定。

3 討論

破傷風是危險性很高的感染性疾病，人體內破傷風IgG抗體的存在主要有兩個來源:一是新生兒由母親體內傳遞來的或普通人群通過被動免疫獲得，二是注射免疫后獲得。接種破傷風疫苗是有效的預防手段，因此，我國一直把百白破疫苗列為基礎免疫疫苗，常規(guī)免疫程序為5劑次，首針接種時間為出生后3個月的嬰兒。了解人群特別是基礎免疫兒童的破傷風保護抗體水平很有必要。

ELISA法檢測因其具有快速、敏感、特異、簡便、結果容易判定等特點，最近幾年被廣泛用于人血清中細菌抗體水平的檢測。有實驗表明，ELISA法檢測血清破傷風IgG抗體的靈敏度可達到0.004 U/ml［2］。采用間接 ELISA 法檢測百日咳、白喉和破傷風抗體，在敏感性、快速性和結果客觀性及可操作性等方面均優(yōu)于間接血凝法，是代替?zhèn)鹘y(tǒng)的小鼠中和試驗法的有效辦法。

不同地區(qū)、不同種族的人群機體中破傷風IgG抗體與試劑盒的反應性強弱存在差異，各實驗室應根據自己實際條件及接觸人群建立正常參考值。世界衛(wèi)生組織(WHO)認為，ELISA法檢測時，血清中的中和抗體≥0.1 U/ml才被認為是陽性，該標準為人破傷風抗毒素血漿的篩查工作，和百白破疫苗全程免疫后人體破傷風抗毒素水平的檢測提供了重要參考依據。

表2 基礎免疫不同年齡段兒童血清破傷風IgG抗體水平Table 2 Tetanus antibodies level in different age children with fundamental immunity

本次抽樣采集的262份0～7歲基礎免疫兒童血清樣品，分別用“安圖試劑盒”和“MP試劑盒”檢測破傷風IgG抗體，在實驗結果判定時，依據國際標準，確定0.1 U/ml作為破傷風抗體最低保護濃度。檢測結果抗體陽性率分別為55.73%和58.78% ，兩種試劑盒檢測結果無差異。有資料報道，1～14歲兒童破傷風IgG抗體達到保護水平 (≥0.1 U/ml)的比例可達到94.55%［3］，而本研究結果顯示鄭州市0～7歲基礎免疫兒童破傷風IgG抗體保護率僅達到55%左右，此結果提示今后加強兒童百白破三聯(lián)疫苗注射的必要性。

根據衛(wèi)生部《計劃免疫管理規(guī)程》要求，新生兒出生后3個足月開始接種百白破疫苗第1針，說明該人群為破傷風易感人群。此次的檢測結果均顯示，＜3個月新生兒破傷風的保護率在30%以內，這與文獻報道“新生兒出生時具有與母親相同或稍高的破傷風抗體的滴度，從而可使新生兒短暫獲得對破傷風的被動免疫保護”相符［4］;同時，檢測結果也反映出兒童在未免疫的低月齡 (1～2個月)內最易發(fā)病的實際情況。有關文獻建議將免疫程序中的百白破疫苗初免月齡由3個月齡提前到2個月齡，與國際上許多國家一致［5］。

檢測結果中39名3個月齡兒童的破傷風抗體保護率僅為15%左右，提示3個月左右未接種破傷風疫苗的嬰兒自身抗體水平較低，體內并不存在來自于母體的抗百日咳、抗白喉、抗破傷風的三種特異抗體，完全不足以抵抗三種疾病的侵襲，使得未免疫嬰兒3個月齡內患百日咳、白喉、破傷風的危險性增加。

本研究中，34名4～6個月新生兒，均為破傷風疫苗連續(xù)接種3針，完成了百白破疫苗的基礎免疫。檢測結果顯示，破傷風抗體保護率達到82.29%，達到了《計劃免疫管理規(guī)程》規(guī)定的＞75.0%的要求;54名6～18個月兒童的破傷風的保護率也達到80%以上，與4～6個月的新生兒相比，破傷風抗體濃度基本持平?！队媱澝庖吖芾硪?guī)程》規(guī)定，新生兒在1歲半至2周歲時再用百白破疫苗加強免疫1針，6周歲時用精制白喉疫苗或精制白破二聯(lián)疫苗加強免疫1針。本研究結果顯示，＞1.5歲的新生兒，破傷風的保護率均為85%左右，與6～18個月兒童相比，破傷風保護率又有所提高，達到了《計劃免疫管理規(guī)程》規(guī)定的＞75.0%的要求。

本研究結果提示，本地區(qū)0～7歲基礎免疫兒童血清破傷風IgG抗體保護率較低，加強人群破傷風類毒素免疫很有必要。3個足月的新生兒應及時按照規(guī)范要求，全程接種百白破疫苗，并按照規(guī)定接種加強針，以維持體內足夠的抗體水平。

1 衛(wèi)生部.預防接種工作規(guī)范［R］.衛(wèi)疾控發(fā)〔2005〕373號.

2 郭立君，邵華，楊麗華，等.破傷風抗體IgG酶聯(lián)檢測試劑盒的研制 ［J］.中國生物制品學雜志，2003，16(4):225－226.

3 沈月根，姜霞玲，顧謝君.嘉興市秀洲區(qū)健康人群百日咳、白喉、破傷風抗體水平監(jiān)測 ［J］.中國計劃免疫，2004，10(1):37.

4 孫月平.對育齡婦女破傷風免疫狀況的分析［J］.細胞與分子免疫學雜志，2007，23(2):175.

5 侯啟明.不同區(qū)域嬰兒抗百日咳、白喉、破傷風母體抗體水平的調查 ［J］.中國計劃免疫，2006，12(3):209－211.