Livin和Caspase－3在散發性大腸管狀腺瘤癌變過程中的表達及相關性研究

吳文新，劉惠民，崔愛榮，崔晉峰，張杰英，張祥宏

在大腸癌的“腺瘤－癌演進學說”中，細胞增殖與凋亡失衡是大腸癌發生的重要機制。Livin作為新發現的凋亡抑制蛋白，其異常高表達能抑制細胞凋亡，促進細胞異常增生并向惡性轉化［1－2］。Caspase－3是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，它通過級聯反應介導細胞凋亡。目前，關于Livin和Caspase－3在腫瘤中表達的研究國內外已有報道［3－4］，但Livin與Caspase－3在散發性大腸管狀腺瘤癌變過程中的可能作用少有報道。本研究采用免疫組化法檢測了118例散發性大腸管狀腺瘤伴上皮不同程度異型增生及癌變組織中Livin和Caspase－3的表達情況，并研究兩者的關系，以探討Livin和Caspase－3在大腸管狀腺瘤癌變中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院病理科2004年12月—2009年12月切除的散發性大腸管狀腺瘤存檔蠟塊，由兩位高年資病理醫師對全部切片進行復診。診斷為大腸管狀腺瘤及癌變的組織118例，其中大腸管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生及癌變病例分別為30、33、26和29例。同時選取25例正常大腸黏膜作對照。

1.2 免疫組化染色方法 采用免疫組化SP法對所有組織進行染色。實驗按照說明書操作，兔抗人Livin多克隆抗體為Nanspec公司產品，稀釋濃度為1∶150，兔抗人Caspase－3多克隆抗體為Santa Cruz公司產品，稀釋濃度為1∶100，以磷酸鹽緩沖液 (PBS)替代一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 Livin和Caspase－3陽性表達主要定位于細胞質，染色結果根據染色強度和陽性細胞百分比進行綜合計分。即隨機選取5個高倍鏡視野計數陽性細胞百分比的平均數，陽性細胞百分比＜5%、5% ～35%、36% ～70%和＞70%時分別計為0、1、2、3分;染色強度以多數陽性細胞呈現的染色計分，陽性細胞著色強度為無色、淡棕色、棕黃色和棕褐色時分別計為0、1、2、3分;將陽性細胞百分比和著色強度兩者的計分相加，0～1分為陰性 (－)，≥2分為陽性 (+)。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件，計數資料采用χ2檢驗，Spearman相關分析進行統計學處理，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Livin表達情況 Livin陽性反應主要定位于細胞質，呈棕黃色。正常大腸黏膜組、大腸管狀腺瘤伴異型增生組及癌變組的Livin陽性表達率分別為16.0% (4/25)、57.3% (51/89)和86.2%(25/29)，3組的Livin陽性表達率間差異有統計學意義 (χ2=27.027，p＜0.05，見圖1、圖2)。大腸管狀腺瘤伴異型增生組和癌變組的Livin陽性表達率均明顯高于正常大腸黏膜組 (χ2值分別13.335和26.617，p＜0.05)，癌變組的Livin陽性表達率亦高于大腸管狀腺瘤伴異型增生組 (χ2=7.971，p＜0.05)。大腸管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生組Livin陽性表達率分別為50.0%(15/30)、54.5%(18/33)和69.2%(18/26)，差異無統計學意義 (χ2=2.268，P＞0.05)。

2.2 Caspase－3表達情況 Caspase－3陽性反應定位于細胞質，呈棕黃色。正常大腸黏膜組、大腸管狀腺瘤伴異型增生組及癌變組的Caspase－3陽性表達率分別為76.0% (19/25)、40.4%(36/89)和10.3% (3/29)，3組的Caspase－3陽性表達率間差異有統計學意義 (χ2=24.006，p＜0.05，見圖3、圖4)。大腸管狀腺瘤伴異型增生組和癌變組的Caspase－3陽性表達率均明顯低于正常大腸黏膜組 (χ2值分別為9.879和23.972，p＜0.05)，且Caspase－3在癌變組的表達明顯低于在大腸管狀腺瘤伴異型增生組的表達 (χ2=8.959，p＜0.05);大腸管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生組Caspase－3陽性表達率分別為66.7% (20/30)、39.4% (13/33)和11.5% (3/26)，差異有統計學意義 (χ2=17.598，p＜0.05)。

2.3 Livin和Caspase－3表達的關系 Livin和Caspase－3的表達呈負相關 (r=－0.305，p＜0.05，見表1)。

表1 大腸管狀腺瘤伴異型增生組及癌變組Livin和Caspase－3表達的關系Table 1 Correlation between the expression of Livin and Caspase－3 in colorectal tubular adenoma and with different dysplasia and with cancerous changes

圖1 大腸管狀腺瘤伴上皮異型增生，Livin在細胞質呈陽性表達(SP，×200)Figure 1 Positive expression of Livin in colorectal tubular adenoma with mild dysplasia

圖2 大腸管狀腺瘤癌變，Livin在細胞質呈強陽性表達(SP，×100)Figure 2 Strong positive expression of Livin in colorectal tubular adenoma with cancerous changes

圖3 大腸管狀腺瘤伴上皮異型增生，Caspase－3在細胞質呈陽性表達 (SP， ×100)Figure 3 Positive expression of Caspase－3 in colorectal tubular adenoma with dysplasia

圖4 大腸管狀腺瘤癌變，Caspase－3在細胞質呈陰性表達 (SP，×100)Figure 4 Negative expression of Caspase－3 in colorectal tubular adenoma with cancerous changes

3 討論

大腸管狀腺瘤被認為是大腸癌主要的癌前病變［5］，目前研究表明腫瘤的發生、發展與細胞凋亡基因及抑制細胞凋亡基因相互調控作用密切相關。

Livin是近年發現的凋亡抑制蛋白家族 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)成員之一，因其特異性高表達于大多數腫瘤組織，與腫瘤的發生、發展相關，已成為當今研究的熱點［6］。已有研究表明，Livin在大腸癌中表達增高并發揮其相應的作用［7］，但有關Livin在散發性大腸管狀腺瘤癌變過程中的表達報道較少。本研究結果顯示，Livin隨異型增生程度的增高及癌變的出現，其陽性表達率逐漸增高，且明顯高于正常大腸黏膜組，提示Livin表達上調可能是細胞逃離凋亡監視機制，造成異常的增殖，并使異常分化的細胞不斷積累，由此推進病程進展，并向惡性轉化，促使大腸管狀腺瘤發生癌變，說明Livin的異常表達與大腸管狀腺瘤癌變關系密切，可能參與了大腸管狀腺瘤癌變的發生。

研究顯示，Livin抑制細胞凋亡作用途徑主要與Caspase家族相互作用，而Caspase－3是Caspase家族中重要的凋亡執行者［8］。Livin主要通過其 BIR區與半胱氨酸蛋白水解酶(Caspases家族)結合，抑制其活性，阻止Caspase－3蛋白在細胞凋亡時執行蛋白切除功能，達到阻斷凋亡的作用。本研究結果顯示，在大腸管狀腺瘤癌變過程中，隨異型增生程度的增高及癌變的出現，Caspase－3的表達呈遞減趨勢，說明Caspase－3能促進細胞正常死亡，抑制癌的發生，提示Caspase－3可能在大腸管狀腺瘤癌變的發生、發展中起重要作用。此外，Livin與Caspase－3在大腸管狀腺瘤癌變中表達呈負相關，Caspase－3蛋白在腺瘤癌變過程中被Livin抑制而表達降低，提示二者可能共同參與了大腸管狀腺瘤癌變的發生過程，這證實Livin對誘發凋亡的效應性蛋白酶Caspase－3可能有直接抑制作用［8］。

總之，Livin不僅參與了細胞凋亡的調控，還促進了細胞增殖，Livin可能下調Caspase－3的表達，共同促進大腸管狀腺瘤癌變的發生，Livin有望成為結直腸癌靶向治療的一個新靶點。本課題組對大腸管狀腺瘤癌變中細胞凋亡基因及抑制細胞凋亡基因間的相互調控作用有待進一步深入研究。

1 Salvesen CS，Duckett CS.IAP proteins:blocking the road to death's door［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(6):401 －410.

2 甄海寧，章翔.新的凋亡抑制因子Livin［J］.第四軍醫大學學報，2004，25(19):1822－1823.

3 薛書霞，張景華，李景武，等.Clusterin、Livin、Caspase-3蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達［J］.海南醫學院學報，2011，17(12):1612－1617.

4 周衛東.Caspase－3和Survivin在膀胱移行細胞癌中的表達及其相關性［J］.中國全科醫學，2009，12(7):1339.

5 鄭杰.結直腸息肉和結直腸癌［J］.中華病理學雜志，2005，34(1):4－5.

6 Gzzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1):85－90.

7 肖維，彭健，張陽德.聯合檢測外周血癌胚抗原mRNA及livin mRNA對早期發現大腸癌微轉移腫瘤的意義研究［J］.中國全科醫學，2011，14(6):2040.

8 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.JBiol Chem，2001，276(5):3238－3246.