體外循環再灌注血培養誘導腎小管細胞凋亡及烏司他丁的保護作用研究

鄧永花，賴前成，萬居易，伍長學，王 波，廖 斌

烏司他丁是一種廣譜酶抑制劑，能夠抑制炎性遞質釋放及對缺血再灌注器官具有保護作用［1］。體外循環是目前心臟外科心內直視手術不可避免的復雜的病理生理過程，復雜的管道系統、體外循環轉機時間、灌注流量和壓力、灌流模式等多種因素可導致患者術后發生腎功能損傷［2］。目前較少直接觀察烏司他丁對體外循環缺血再灌注血清對人腎小管細胞損傷作用的保護。為此，本研究初步觀察了體外循環后血清直接對人近曲腎小管上皮細胞HK－2損傷的作用，旨在探討烏司他丁對腎功能保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人HK－2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM(GIBCO);胰酶 (OXODI);胎牛血清 (成都哈里公司);Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋公司);SP9000免疫組化染色試劑盒 (北京中杉金橋公司);多聚賴氨酸，DAB顯色試劑盒 (武漢博士德公司);烏司他丁 (廣東天普生化醫藥股份有限公司生產);其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 HK－2細胞株的復蘇、培養、傳代 從液氮罐中取出凍存的HK－2細胞投入37℃的溫水中，搖動使其盡快解凍。吸出細胞懸液并滴加10倍體積的含10%胎牛血清的DMEM培養基，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后再重復洗滌1次。用含10%胎牛血清的DMEM培養液將細胞懸液稀釋混勻，接種于100 ml培養瓶中，37℃下5%二氧化碳 (CO2)細胞培養箱中靜置12 h，換液除去未貼壁細胞后至細胞長滿成片80%以上。用質量分數為0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。

1.2.2 正常人、體外循環再灌注血清的制備 隨機采集6例健康志愿者的外周血5 ml，立即在4℃離心機1 500 r/min離心15 min收集上清，－20℃保存備用。隨機選取我科體外循環手術主動脈阻斷時間在60 min以上的心臟手術患者12例，于開放主動脈1 h后采集外周血5 ml，立即在4℃離心機1 500 r/min離心15 min收集上清，－20℃保存備用。

1.2.3 腎小管上皮細胞缺血再灌注模型的建立 (1)培養腎小管上皮細胞的缺血模擬:100%N2飽和無糖無機鹽緩沖液40 min，吸棄6孔板及培養瓶內的細胞培養基，用無糖無機鹽緩沖液沖洗，加入100%N2飽和無糖無機鹽緩沖液，置95%N2+5%CO2環境培養2 h。(2)培養腎小管上皮細胞的再灌注模擬及分組:吸棄6孔板及培養瓶內無糖無機鹽緩沖液沖液后，空白組不含血清;對照組以正常人血清代替再灌注血清;試驗組加入含10%體外循環再灌注血清的DMEM低糖培養基，置95%O2+5%CO2環境培養4 h;烏司他丁組以改良的缺血再灌注方式處理腎小管上皮細胞的過程中，施加烏司他丁干預。處理后的6孔板內的腎小管上皮細胞用于免疫細胞化學法(ICC)檢測。培養瓶內的腎小管上皮細胞消化離心洗滌后采用流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.2.4 細胞凋亡檢測分析 胰酶消化細胞，PBS清洗2次，加入適量的熒光標記的annexin V試劑和碘化丙啶 (PI)，混勻后避光室溫下孵育15 min，孵育后加入400μl染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析并記錄結果。

1.2.5 caspase－3蛋白表達檢測 按試劑盒說明書操作采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白 (Streptavidin/Peroxidase，SP)染色的免疫組化檢測caspase－3蛋白表達。圖像分析采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統統計積分分光光度值 (IOD)。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計分析，計量資料以()表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測結果顯示，體外循環血清處理后，4組腎小管上皮細胞HK－2凋亡率比較，差異有統計學意義 (p＜0.05);其中試驗組較空白組、對照組、烏司他丁組均明顯升高，差異均有統計學意義 (q值分別為17.85、18.98和29.64，P=0.00);空白組與對照組比較差異無統計學意義 (q=0.34，P=0.39);烏司他丁組與空白組、對照組比較差異均無統計學意義 (q值分別為0.59和0.56，P值分別為0.31和0.36，見表1)。

2.2 caspase－3蛋白免疫細胞化學染色 4組caspase－3蛋白IOD值比較差異有統計學意義 (p＜0.05);其中試驗組較空白組、對照組、烏司他丁組均明顯升高，差異有統計學意義(q值分別為32.44、31.72和27.68，P=0.00);空白組與對照組比較差異無統計學意義 (q=1.10，P=0.27);烏司他丁組與空白組、對照組比較差異均無統計學意義 (q值分別為1.50和1.60，P=0.22和0.25，見圖1、表2)。

表1 4組腎小管上皮細胞HK－2凋亡率比較 (x ±s，%)Table 1 Comparison of apoptosis rate of HK－2 cells in four groups

圖1 caspase－3蛋白免疫細胞化學 (IHC)染色Figure 1 IHC staining of caspase－3 protein

表2 4組caspase－3蛋白IOD值比較Table 2 Comparison of IOD in four groups

3 討論

烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α－糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶具有抑制作用［3］，動物實驗也證實其具有穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子 (MDF)產生，清除氧自由基及抑制腫瘤壞死因子－α(TNF－α)等炎性遞質釋放的作用［4－5］。體外循環心臟手術后急性腎衰竭(AKI)的發生率為20% ～30%，其腎損害輕重不一［6］。動物實驗證實體外循環并發AKI主要原因是導致腎小管損傷［7］，其致病因素較復雜，包括缺血再灌注損傷及全身炎性遞質，常是綜合性因素所致［8］。

本研究體外培養HK－2細胞，用體外循環手術主動脈阻斷時間在60 min以上的患者，于開放主動脈1 h后血清，真實全面地模擬手術后體內各個器官，多種因素參與的致病因子［9］。同時應用缺氧復氧模擬體內阻斷時的缺血再灌注損傷。結果顯示細胞凋亡率較對照組與空白組明顯增加，而給予烏司他丁培養后凋亡率明顯下降。

caspase－3是凋亡執行的重要效應分子，是凋亡發生的關鍵效應酶。其表達的增加、激活是凋亡信號轉導路徑中的關鍵環節，是凋亡啟動過程中的早期事件，是參與調節和執行細胞凋亡最重要的蛋白酶之一［10－11］。烏司他丁組較試驗組能明顯降低caspase－3表達，提示其可能抑制細胞內依賴caspase的凋亡途徑，從而保護腎小管細胞。但仍需進一步觀察其對整體腎功能保護作用。

綜上所述，心臟手術體外循環后血清通過多種因素導致細胞凋亡，而烏司他丁能廣泛抑制多種炎性遞質對HK－2細胞的損傷作用，其機制可能與抑制caspase－3表達減少細胞凋亡有關。

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10 吳廣禮，黃旭東，張麗霞.過度訓練可通過破壞Bax/Bcl－2平衡激活caspase依賴的凋亡通路誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡 ［J］.中華腎臟病雜志，2011，27(2):118－123.

11 楊孟昌，陳玉培，徐茜，等.乳化異氟醚對缺氧/復氧乳鼠心肌細胞的作用及對caspase－3表達的影響 ［J］.中國全科醫學，2009，12(4):625.