Graves病患者血漿熱休克蛋白70水平變化及其意義

李霞緋，李 強，陳紫君，劉 純

熱休克蛋白 (heat shock protion，HSP)是一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質分子家族，普遍存在于原核和真核細胞中，從細菌到哺乳動物體內均可見其表達［1］。人們發現缺血、缺氧、重金屬、病毒感染、惡變等刺激均可引發細胞的應激反應，從而合成HSP，故又稱為應激蛋白［2］。已有研究發現，Graves病 (Graves disease，GD)患者甲狀腺［3］以及Graves眼病 (Graves ophthalmopathy，GO)患者球后成纖維細胞上［4］都有HSP70的過量表達，且參與了疾病的自身免疫過程。越來越多的研究顯示，細胞內HSP70可以進入細胞外環境參與許多疾病的發生發展，在某些疾病患者的循環血液中也檢測到高于正常人水平的HSP70，如心肌梗死［5］、動脈粥樣硬化［6］等，并且血液中細胞外HSP70水平與疾病的炎癥反應密切相關。細胞外HSP70能通過古老的TOLL樣受體 (toll like receptors，TLRs)信號途徑激活巨噬細胞、單核細胞和樹突細胞，HSP70和TLRs結合后，所激活的下游信號轉導途徑和白介素1受體 (interleukin－1 receptor，IL－1R)基本相同，均通過信號轉導級聯反應MyD88→IRAK→TRAF6/ECSIT→NIK/IKK，引起核轉錄因子κB(nuclear factor－κB，NF－κB)的活化，最終引起巨噬細胞、單核細胞和樹突細胞釋放炎性細胞因子［7］。本研究旨在通過檢測GD患者血漿中HSP70及炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF－α)的水平變化以及GD患者外周血單個核細胞內炎癥信號通路的起始點TLR及終末點NF－κB的基因表達，來探討細胞外HSP70在GD發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年3—7月我院內分泌門診確診的GD初發患者25例 (病例組)，其中男8例，女17例;平均年齡 (33.9±6.7)歲;同時收集本院25例健康體檢者 (對照組)，其中男8例，女17例;平均年齡 (34.4±6.3)歲。病例組符合第7版《內科學》GD診斷標準:有典型甲狀腺功能亢進癥狀、體征，伴有游離三碘甲狀腺原氨酸 (FT3)、游離甲狀腺素 (FT4)水平升高，促甲狀腺素 (sTSH)水平降低及甲狀腺過氧化物酶抗體 (TPO－Ab)和 (或)甲狀腺球蛋白抗體 (Tg－Ab)、促甲狀腺素受體抗體 (TRAb)升高，均未接受過抗甲狀腺藥物治療。研究對象均排除近期感染史、妊娠、精神創傷、劇烈運動以及合并心血管慢性疾病、腫瘤、類風濕等與自身免疫有關的疾病。血液標本采自禁食12 h以上的靜脈血，并及時離心分離血清，放置－20℃保存。

1.2 方法 血清HSP70、TNF－α和TRAb采用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)法測定，外周血單個核細胞TLR4及NF－κB的mRNA表達用反轉錄聚合酶鏈反應 (RT－PCR)測定，試劑盒分別由武漢中美科技和R＆D提供。丙二醛 (MDA)采用比色法測定，試劑盒由南京生物建成提供。FT3、FT4、sTSH、TPO－Ab、Tg－Ab采用化學發光法測定，由重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌實驗室測定。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件包進行統計檢驗。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗;相關分析采用等級相關法 (Pearson法)。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 病例組患者血漿HSP70、TNF－α、MDA水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義 (p＜0.05，見表1)。

表1 病例組與對照組受檢者血漿HSP70、TNF－α、MDA水平比較Table 1 Comparison of levels of HSP70，TNF－α，MDA in GD and normal controls

表1 病例組與對照組受檢者血漿HSP70、TNF－α、MDA水平比較Table 1 Comparison of levels of HSP70，TNF－α，MDA in GD and normal controls

注:HSP70=熱休克蛋白70，TNF－α=腫瘤壞死因子α，MDA=丙二醛

組別 例數 HSP70(ng/L)TNF－α(ng/L)MDA(μmol/L)病例組25 168±101 27.5±12.1 7.22±0.91對照組 25 42± 18 7.1± 2.6 4.04±0.57 t 值6.144 4.62 12.809 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

2.2 相關分析顯示，病例組GD患者血漿HSP70水平與TNF－α、MDA、FT3、FT4呈正相關，與 sTSH呈負相關 (p＜0.05);血漿HSP70水平與TPO－Ab、Tg－Ab、TRAb無相關性 (P＞0.05，見表2)。

表2 病例組GD初發患者血漿HSP70水平與各因素的相關性Table 2 Relationship between HSP70 with TNF－α，MDA，hyroid function and autoimmune antibodies in GD patients

2.3 病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA表達量 (0.185±0.006)顯著高于對照組 (0.081±0.039)，差異有統計學意義 (t=13，p＜0.01);NF－κB mRNA表達量 (0.73±0.049)亦顯著高于對照組 (0.31±0.039)，差異有統計學意義 (t=31，p＜0.01)。

3 討論

GD患者甲狀腺［3］以及GO患者球后成纖維細胞上［4］都有HSP70的過量表達，且提示細胞內HSP70參與了疾病的發生。本研究結果顯示，GD患者血漿中HSP70水平顯著高于健康者，提示GD患者細胞外HSP70水平上升;同時，與健康者比較，GD患者血漿氧化應激產物MDA及炎性細胞因子TNF－α水平也有顯著升高，而且GD患者血漿HSP70水平與TNF－α、MDA水平呈正相關。其實活性氧族和炎性細胞因子均可誘導細胞內HSP70的過量表達［8］。而且炎性細胞因子可以誘導HSP70的細胞外釋放［9］。另外，氧化應激也被認為參與了鍛煉誘導的循環HSP70升高，并且用維生素C和維生素E能抑制其升高［10］。應激誘導的細胞外HSP70能作為一個細胞內的應激信號分子，提示細胞應激或損傷，從而引出先天免疫和獲得性炎癥免疫反應［11］。HSP70激活細胞內炎癥信號通路主要是通過與細胞表面TLR結合，激活的下游信號轉導途徑和IL－1R基本相同，均通過信號傳導級聯反應MyD88→IRAK→TRAF6/ECSIT→NIK/IKK，引起NF－κB的活化，最終引起巨噬細胞、單核細胞和樹突細胞釋放炎性細胞因子并最終激活NF－κB來完成的［7］。有研究者用“危險理論”［12］來解釋其功能:應激所產生的細胞外HSP70可能作為一種“危險信號”促進機體的免疫功能，從而幫助清除病原體。在急性炎癥時，細胞外HSP70通過TLR2和 (或)TLR4激活免疫細胞，產生一氧化氮和其他炎性因子，促使病原物的清除和炎癥的減退。而在慢性炎癥性疾病時，應激誘導的細胞外HSP70使炎性因子水平持續過度升高，反而導致病情惡化。GD的發病機制已公認主要與免疫因素有關，其病理損傷實際上是一種免疫炎性反應過程［13］。本研究發現血漿中HSP70和TNF－α水平均顯著高于健康者，并且血漿HSP70水平與TNF－α及甲狀腺功能相關。而且GD患者外周血單個核細胞上炎癥反應鏈的起始點TLR4和終末環節NF－κB的mRNA表達均較健康者顯著增加。提示內源性細胞外HSP70可能通過TLR4激活細胞內信號通路，引起NF－κB的活化，最終引起巨噬細胞、單核細胞和樹突細胞釋放炎性細胞因子，從而激活和加劇GD的炎癥反應。

細胞外HSP70除了刺激炎性因子的產生，還能促進抗原呈遞細胞 (antigen－presenting cell，APC)的成熟和遷移，以及APC和T淋巴細胞的相互作用，從而引發獲得性免疫反應［14］。細胞外HSP70能在抗原加工過程中與抗原肽結合，形成的HSP－肽復合物經壞死或瀕死細胞釋放后與APC上的受體結合，抗原通過HSP被遞送給主要組織相容性復合體－I［15］，同樣說明HSP能夠刺激獲得性免疫反應。GD是一種自身免疫性疾病，體液免疫和細胞免疫均參與了GD的發病。本研究還發現GD患者血漿中升高的HSP70與TPO－Ab、Tg－Ab、TRAb不相關，提示GD患者體內自身免疫反應是一個復雜的病理過程，其變化可能與個體自身的免疫過程有關，同時提示細胞因子間有著非常復雜的相互作用關系，細胞因子的網絡失調可能造成了GD的發生發展。

總之，升高的血漿HSP70水平反映了GD的系統炎癥和疾病的嚴重程度，但需要更進一步的研究來證實血漿HSP70在GD中的免疫調節作用。

1 Tolly C，Morimoto RL.Role of the heat shock response and molocular chaperones in oncogenesis and cell death ［J］.Nat Caner Inst，2000，92(19):1564－1572.

2 宋曉聰，楊芳芳，胡丹，等.腺病毒介導的熱休克蛋白70表達對神經元氧化應激損傷的保護作用［J］.中國全科醫學，2010，13(2):494.

3 Trieb K，Sztankay A，Herrmann M，et al.Do heat shock proteins play a role in Graves'disease?Heat shock protein－specific T－cells from Graves'disease thyroids do not recognize thyroid epithelial cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，1993，77(2):528－535.

4 Dybdahl B，Slordahl SA，Waage A，et al.Myocardial ischaemia and the inflammation response:release of heat shock protein70 after myocardial infarction ［J］.Heart，2005，91(3):299－304.

5 杜培宜，黃北春，杜松，等.自身免疫性甲狀腺疾病患者血漿丙二醛與炎癥因子的檢測及臨床意義［J］.中華全科醫師雜志，2008，7(7):483－485.

6 孫蔚明，湯旭磊，劉曉菊，等.格雷夫斯病患者體內抗氧化狀態及氧化損傷的研究 ［J］.中國病理生理雜志，2004，20(12):2265－2267.

7 宋軍民，曾玉劍，李園，等.細胞外熱休克蛋白70在全身炎癥反應中的作用 ［J］.山東醫藥，2008，48(18):29－30.

8 田竹芳，華郁.Graves病患者血液學異常的特點及相關因素分析［J］.中國全科醫學，2010，13(3):855.

9 Vega VL，Rodriguez－Silva M，Frey T，et al.Hsp70 translocates into the plasma membrane after stress and is released into the extracellular environment in a membrane－associated form that activates macrophages［J］.JImmunol，2008，180(6):4299 －4307.

10 Yamada P，Amorim F，Moseley P，et al.Heat shock protion 72 response to exercise in humans［J］.Sports Med，2008，38(9):715－733.

11 Pockley AG.Heat shock proteins as regulators of the immune response［J］.Lancet，2003，362(9382):469 －476.

12 Lee MS，Kim YJ.Signaling pathways downstream of pattern－recognition receptors and their cross talk ［J］.Annu Rev Biochem，2007，76:447－480.

13 Prohaszka Z，Fust G.Immunological aspects of heat－shock proteinsthe optimum stress of life［J］.Immunol，2004，41(1):29－44.

14 Tsan MF，Gao B.Heat shock proteins and immune system ［J］.J Leukoc Biol，2009，85(6):905 －910.

15 Qiao Y，Liu B，Li Z.Activation of NK cells by extracellular heat shock protein 70 through induction of NKG2D ligands on dendritic cells ［J］.Cancer Immun，2008，8:12.