Gateway技術構建結縷草低溫和干旱誘導cDNA文庫及其質量鑒定

王 舟，宗俊勤，郭海林，劉建秀

(1.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京210014；2.廣西梧州市產品質量監督檢驗所，廣西 梧州543001)

結縷草(Zoysiajaponica)是暖季型草坪草中最抗寒的草種，具有良好的耐旱、耐鹽堿、耐踐踏、耐瘠薄、抗病蟲害等特性[1-2]，這決定了它擁有眾多的優良性狀和豐富的遺傳多樣性，是很好的研究植物抗性機制的草坪草。而如何有效發掘利用這些有利基因一直是研究的熱點，但結縷草遺傳背景復雜，通過常規的基因克隆方法獲取有利基因存在許多問題，效率極低。cDNA文庫的構建是研究不同發育階段和特定時期的基因表達、分離組織特異性基因以及克隆新型細胞因子的有利工具[3-4]。由于cDNA文庫是生物體在特定發育時期轉錄的全部mRNA經反轉錄而成的cDNA片段與載體連接形成的克隆的集合，故不含有內含子[5-6]。源于這些cDNA片段的短的、單向測定的序列片段即為表達序列標簽(Expressed Sequence Tag，EST)，是一種發現新基因和研究基因表達譜的有效工具[7-8]。通過大規模的EST測序分析，可以獲得基因組中編碼序列區的核苷酸全序列圖，并可通過已知功能基因的相似性分析推測每條EST所代表基因的功能。自20世紀70年代中期首例cDNA克隆問世以來，cDNA文庫已經被廣泛應用于構建遺傳學圖譜、分離與鑒定新基因、基因差異表達和比較基因組學、功能基因組學等研究[9]。目前擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10-11]、水稻(Oryzasativa)[12]、小麥(Triticumaestivum)[13]、玉米(Zeamays)[14]和棉花(Gossypiumhirsutum)[15-16]等重要植物的全長cDNA文庫已成功構建并用于后期蛋白質表達及功能分析[17-18]。近年來，EST和cDNA文庫篩選已成為一種高效率、低成本的發現未知新基因的快捷技術[9,19-20]。特別是對非模式物種，通過cDNA文庫篩選目的基因更具明顯優勢[21]。

相對于擬南芥、水稻、小麥等植物，結縷草的分子生物學研究還屬起步階段，多集中于采用分子標記手段進行遺傳分析及親緣關系的鑒定[22-25]，而對功能基因的分離研究鮮有報道。截至目前，GenBank中登錄的來源于結縷草的核苷酸序列僅有197條，遠遠落后于其他園藝觀賞植物，而dbEST中甚至沒有結縷草EST的登錄信息記錄。在這197條序列中絕大部分為葉綠體相關基因，其次為線粒體相關基因、NADH脫氫酶基因等，而對這些基因的研究多是用作分子標記為鑒定結縷草品種親緣關系服務的。結縷草基因的分離主要是通過蛋白質純化、N端氨基酸序列分析以及RACE等方法獲得，而有關結縷草cDNA文庫方面的研究國內外尚未見報道。

為進一步獲取結縷草抗逆信號轉導途徑中的關鍵基因信息，從分子水平深入挖掘和利用結縷草潛在的基因資源，完善其基因組信息，本研究以坪用價值高的優良結縷草品種Meyer為建庫材料，經低溫和干旱誘導處理，采用先進的Gateway技術首次成功地構建了包含結縷草抗寒、抗旱特異性表達基因的高質量cDNA文庫，旨在為今后大規模EST測序、基因表達譜分析、分離克隆具有育種價值的抗逆相關基因，研究其功能及代謝途徑和網絡提供理論依據和技術支撐，為開展分子育種工作開辟一條新的途徑。這對改善我國草坪業的自主知識產權現狀具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 供試結縷草品種為美國引進的優良品種Meyer(Z.japonicacv.Meyer)。對在自然條件下萌發生長6周的健壯植株分別進行低溫和干旱處理。1)低溫處理：將材料置于4 ℃下冷處理5～6 h；2)干旱處理：將材料置于25 ℃人工培養箱中，停止澆水4～5 d，直至土壤出現龜裂。收集上述處理材料的葉片用液氮速凍后，-80 ℃保存備用。

1.1.2文庫載體 pCMV·SPORT6，具有Gateway兼容性(Gateway Compatibility)，在其多克隆位點(Multiple Cloning Site，MCS)的雙側翼含有GatewayattB1和attB2重組位點。

1.1.3主要試劑 cDNA文庫構建試劑盒(SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning)、RNA提取試劑(TRIzol Reagent)、mRNA分離試劑盒(FastTrack 2.0 Kit)、反轉錄試劑盒(SuperScriptTMII First-Strand Synthesis System for RT-PCR)、DNA分子量標記(1 kb Plus DNA Ladder)、超純瓊脂糖(UltraPureTMAgarose)、熱啟動型DNA聚合酶(Platinum Taq DNA Polymerase)、dNTP混合液(100 mmol·L-1dNTP Set)、超純酚∶氯仿∶異戊醇[UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl Alcohol (25∶24∶1，體積比)]均購自Invitrogen公司，分子生物學用醋酸銨[Ammonium acetate solution for molecular biology (7.5 mol·L-1)]購自Sigma公司。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取 分別取-80 ℃下保存的低溫、干旱誘導后的兩種樣品各100 mg混合，于加有液氮的研缽中迅速研磨后，轉移至RNase-free的1.5 mL離心管中，立即加入1 mL TRIzol提取液，混勻后，后續的操作參照TRIzol說明書進行總RNA的提取。沉淀用75%乙醇洗滌，DEPC處理水溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和穩定性，并用紫外分光光度計測定RNA的純度及含量。

1.2.2mRNA的分離 取大于500 μg的總RNA，參照試劑盒FastTrack 2.0 Kit操作說明書分離和純化mRNA。

1.2.3雙鏈cDNA的合成 取5 μg的mRNA，按照試劑盒SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning使用說明進行操作，SuperScriptTMII RT酶合成cDNA第1鏈。隨后，參照試劑盒操作程序合成cDNA第2鏈。

1.2.4柱層析分級分離及收集 取25 μL cDNA與10 μLSalI接頭(50 ng·μL-1)，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。連接產物用限制性內切酶NotI于37 ℃酶切3 h，產生粘性末端。酶切產物過cDNA Size Fractionation Columns柱(試劑盒提供)，并按試劑盒使用說明收集前150 ng的cDNA產物。

1.2.5連接載體 依試劑盒要求取10 μL cDNA與1 μLNotI-SalI-Cut pCMV·SPORT6載體，在T4 DNA連接酶作用下室溫反應3～5 h或4 ℃連接過夜。

1.2.6電轉化大腸桿菌DH10B 參照試劑盒說明書，在冰上將2 μL連接產物和50 μL電轉感受態細胞DH10B加入電轉杯。TX ECM 630電轉化儀上電擊條件設置為：電壓2.0 kV，電阻200 Ω，電容25 μF。電擊后迅速向電轉杯中加入冰上預冷的SOC培養基1 mL。將電轉物全量轉移至新的1.5 mL離心管中，37 ℃ 225～250 r·min-1振蕩培養1 h，獲得原始文庫。

1.2.7文庫質量評價

1)滴度和庫容量鑒定：取電轉化后的原始文庫原液10 μL稀釋1 000倍后，從中取出50 μL涂布于IPTG/X-Gal的LB平板(含100 μg·mL-1氨芐青霉素)上，37 ℃培養過夜，次日統計菌落數。

2)插入片段大小及重組率鑒定：從原始文庫中隨機挑取50個單克隆，以M13F-M13R為引物，PCR檢測插入片段大小并估計文庫重組率。95 ℃變性5 min裂解菌體后，加入PCR反應混合物，擴增反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析插入片段的大小。

2 結果與分析

2.1總RNA的提取 RNA的完整度與穩定性決定了cDNA的質量，是構建高質量cDNA文庫的關鍵。提取經低溫、干旱誘導后的結縷草葉片總RNA，取2 μL RNA溶液進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果可見兩條清晰的28S和18S rRNA條帶(圖1)，表明提取的總RNA具有良好的完整度及穩定性。紫外分光光度計檢測RNA溶液的OD值，測得OD260 nm/OD280 nm=1.90，說明RNA純度較好，可以用來分離mRNA，為建立高質量結縷草cDNA文庫奠定了基礎。

圖1 提取的結縷草總RNA

2.2mRNA的分離與純化 采用FastTrack 2.0 Kit試劑盒從總RNA中分離和純化mRNA。電泳檢測顯示，mRNA呈均勻彌散狀(圖2)，主要分布在1 000 bp以上，質量良好，符合建庫的要求。

圖2 分離和純化后的mRNA

2.3反轉錄與雙鏈cDNA的合成 用約5 μg mRNA反轉錄合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，取5 μL反轉錄產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果可見，ds cDNA呈彌散狀條帶，主要分布于1 000 bp以上(圖3)，說明不同大小和不同豐度的mRNA都得到了有效的反轉錄和擴增，滿足建庫的需要。

圖3 反轉錄合成的雙鏈cDNA

2.4文庫質量評價

2.4.1cDNA原始文庫的滴度和庫容量鑒定 原始文庫滴度可估計cDNA文庫的克隆數，同時還代表了mRNA的復雜度。將過柱收集的cDNA片段與質粒載體pCMV·SPORT6連接后，轉化到受體菌DH10B。按照SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning試劑盒提供的方法進行文庫滴度和庫容量的測定。

一個高質量的文庫，其滴度應大于1×106pfu·mL-1，庫容量應大于5×106pfu[26]，能保證低豐度基因的出現頻率達到99%[27]。原始文庫稀釋1 000倍后，取50 μL涂布，獲得克隆數88個，經計算得到文庫的滴度為1.76×106pfu·mL-1，庫容量為7.04×106pfu。由此可見，本研究構建的結縷草低溫和干旱誘導cDNA文庫是一個較高質量的文庫，足以克隆到低豐度表達的基因。

2.4.2插入片段大小和重組率鑒定 插入片段大小和重組率是評價cDNA文庫質量的另外兩個重要指標。從原始文庫中隨機挑取的單克隆PCR檢測結果表明，文庫重組率達到90%。插入片段最大可達2.5 kb，主要集中在大于1 kb的區域(圖4)。植物cDNA一般為0.5～3.0 kb，大多大于或等于1 kb[28]。本研究構建的文庫符合構建高質量文庫的標準，文庫中長片段所占比例較大，表明插入片段序列的完整性較好，適合以后的測序及后續篩選基因與基因功能的研究。

圖4 cDNA文庫插入片段大小的PCR檢測

3 討論

植物基因組的研究已經由以全基因組測序為目標的結構基因組學轉向功能基因組學，通過cDNA文庫篩選分離全長基因和開展基因功能研究已成為功能基因組學研究的基本手段之一。cDNA文庫代表了mRNA的反轉錄復本[29-31]，高質量cDNA文庫的構建是大規模EST測序的必要保證，也是有效研究基因表達的基礎。cDNA文庫的質量主要反映在兩個方面：一是文庫的代表性，即文庫中含有的cDNA種類的完整性。只有足夠的克隆數才能保證擁有一定數量的低豐度表達的mRNA，反映來源細胞中所表達的全部遺傳信息。其可用滴度和庫容量的大小來定量衡量，滴度越大表明獲得目的基因的可能性越大。二是插入cDNA片段的序列完整性。只有大部分克隆含有接近全長的cDNA插入，文庫才能體現天然的、完整的遺傳信息，即插入片段的大小越大，表明分離到基因全長的可能性越大。本研究對結縷草供試材料進行了低溫和干旱的誘導處理，可以大幅度提高目的誘導基因的表達豐度，理論上即使是低豐度的基因也可以獲得篩選。此外，從PCR鑒定文庫質量的結果來看，cDNA片段插入重組率高達90%，這也為今后基因分離的效率提供了有力保證。

文庫的滴度、重組率和插入片段的大小是鑒定cDNA文庫質量的重要指標[4,32]。滴度的高低是能否通過篩選cDNA文庫獲得目的基因的衡量依據，高庫容量是文庫測序獲得非重復EST的保證[32]。一般而言，在典型的真核生物中每時每刻表達的mRNA約占生物所有基因的15%，約1.5萬種，其中低豐度mRNA種類約占30%[33]。為使文庫中出現某種低豐度的mRNA這一事件的發生達到給定的概率，則文庫所需的獨立克隆數，可以通過Clack-Carbon公式N=ln(1-P)/ln(1-f)(N為實際所需克隆數，P為要求的概率，f為1/n，n為某一類型的稀有mRNA在總mRNA中所占的相對比例)計算。當要求篩選到某低豐度mRNA的概率為99%時，由上述公式計算出的文庫所需克隆數應不低于1.7×105pfu·mL-1，此即為有效的文庫[32]。但為滿足篩選到低豐度mRNA的要求，一般cDNA文庫構建要求其滴度不少于1×106pfu·mL-1[34]。構建文庫過程中，片段分級分離與載體連接時，cDNA片段大小與cDNA濃度對建庫的影響至關重要，如不能有效去除小片段cDNA，則其會優先與載體連接，導致文庫平均插入片段過小，嚴重影響文庫質量，但過度篩除cDNA片段，則會造成文庫的初始滴度下降，從而丟失一些基因信息。分級分離的標準一般是回收500 bp以上的cDNA片段[35]。針對構建文庫篩選功能基因全長的目的，本研究在保證插入片段較大的同時，兼顧了文庫的滴度。經檢測，本研究所構建的cDNA原始文庫滴度為1.76×106pfu·mL-1，保證了文庫的完整性與覆蓋度，理論上包含了脅迫誘導后結縷草葉片中表達的所有基因[32,36-37]；插入片段的平均大小超過1 kb，重組率為90%，表明序列的完整性很高，能夠包含絕大多數基因表達的cDNA信息，保證了在通過篩選cDNA文庫獲取目的基因時稀有基因不會被遺漏[32,36-37]。由此可見，所構建的文庫達到了完整、有效并且高質量的標準，滿足分離低豐度表達基因序列的要求，可用于后續篩選其中特異表達的低豐度基因、組織特異性基因表達譜分析、基因組序列的功能注釋以及功能基因在轉錄及翻譯水平上調控的分子機制等許多領域的研究。通過EST測序、分子雜交、扣除法等技術探明結縷草生長、發育、次生代謝和生化合成途徑及對環境脅迫反應的分子機理[38-40]，不僅為后期在分子水平上調控結縷草的生長、發育和抗逆性奠定了實驗基礎，還提供了技術平臺和良好的前提材料。

本研究是利用Gateway技術構建的高質量全長cDNA文庫，因此文庫所分離的cDNA克隆包含了相對應的mRNA分子完整的序列。此文庫所用的克隆載體pCMV·SPORT6，具有Gateway兼容性，在其多克隆位點的雙側翼含有Gateway位點特異性的重組位點(attB1和attB2)，cDNA克隆位點即位于多克隆位點內。因此，通過位點特異性重組就可將從文庫分離到的克隆快速轉化至其他Gateway載體，而無需經過限制性內切酶的酶解和連接酶的連接。Gateway克隆可以方便地用于DNA測序、RNA探針制備或者表達重組蛋白。此外，在文庫構建的過程中第2鏈合成采用的是置換合成法，而沒有采用PCR擴增，能夠保持材料中的mRNA原始豐度，而不會由于PCR擴增效率的不同，使得原始豐度在文庫中反映失真，這使一些較低拷貝數基因的克隆具有優勢。同時，作為優化的文庫系統及后期大規模測序結果可以應用于進一步的芯片制作。

cDNA文庫篩選和RACE技術是兩種獲得全長cDNA最重要的方法，其中cDNA文庫篩選還具有高通量的特點，適合于大規模獲得全長cDNA。在此基礎上分析不同基因在逆境脅迫過程中的表達，從中篩選出特異性表達的基因，進一步分析其功能，并最終研究抗逆相關基因調控網絡，為育種工作奠定理論基礎。與農作物(如水稻、小麥等)相比，國內外對草坪草和牧草的開發利用，特別是分子生物學相關研究，還處于起步階段。本研究構建了低溫和干旱誘導的結縷草葉片cDNA文庫，文庫中功能基因的數量、基因表達的豐度與結縷草自身抗寒、抗旱等抗逆性密切相關。目前在公共數據庫中，報道結縷草cDNA文庫尚屬首次。此高質量文庫的成功構建是鑒定和克隆相關重要功能基因及開展分子育種的重要平臺，有助于深入了解結縷草遺傳背景，揭示其抗逆性的分子機理，為進一步獲得擁有自主知識產權的抗逆新品種提供了有力的保障，具有重要的應用價值。

[1]王舟,宗俊勤,宣繼萍,等.結縷草肌動蛋白基因全長cDNA的克隆及序列分析[J].草業學報,2010,19(6):154-163.

[2]胡利珍,關賢交,楊知建,等.野生結縷草坪用性狀的綜合評價[J].草業科學,2010,27(10):23-26.

[3]Galaud J P,Carrière M,Pauly N,etal.Construction of two ordered cDNA libraries enriched in genes encoding plasmalemma and tonoplast proteins from a high-efficiency expression library[J].The Plant Journal,1999,17:111-118.

[4]趙桂媛,魏志剛,劉關君,等.SMART策略構建小黑楊莖形成層全長cDNA文庫[J].北京林業大學學報,2010,32(1):52-56.

[5]Gubler U,Hoffman B J.A simple and very efficient method for generating cDNA libraries[J].Gene,1983,25:263-269.

[6]Miller J,Stagljar I.Using the yeast two-hybrid system to identify interacting proteins[J].Methods in Molecular Biology,2004,261:247-262.

[7]Wang Y C,Chu Y G,Liu G F,etal.Identification of expressed sequence tags in an alkali grass (Puccinelliatenuiflora) cDNA library[J].Journal of Plant Physiology,2007,164:78-89.

[8]楊滿業,王麗煥,葉煜輝,等.干旱脅迫下賴草抑制性消減文庫的構建與分析[J].草業科學,2011,28(7):1320-1325.

[9]Wiemann S,Mehrle A,Bechtel S,etal.cDNAs for functional genomics and proteomics:the German Consortium[J].Comptes Rendus Biologies,2003,326:1003-1009.

[10]Seki M,Carninci P,Nishiyama Y,etal.High-efficiency cloning ofArabidopsisfull-length cDNA by biotinylated CAP trapper[J].The Plant Journal,1998,15:707-720.

[11]Seki M,Narusaka M,Kamiya A,etal.Functional annotation of a full-length Arabidopsis cDNA collection[J].Science,2002,296:141-145.

[12]Kikuchi S,Satoh K,Nagata T,etal.Collection,mapping,and annotation of over 28 000 cDNA clones from japonica rice[J].Science,2003,301:376-379.

[13]Ogihara Y,Mochida K,Kawaura K,etal.Construction of a full-length cDNA library from young spikelets of hexaploid wheat and its characterization by large-scale sequencing of expressed sequence tags[J].Genes and Genetic Systems,2004,79:227-232.

[14]Jia J P,Fu J J,Zheng J,etal.Annotation and expression profile analysis of 2073 full-length cDNAs from stress-induced maize (ZeamaysL.) seedlings[J].The Plant Journal,2006,48:710-727.

[15]Haigler C H,Zhang D,Wilkerson C G.Biotechnological improvement of cotton fibre maturity[J].Physiologia Plantarum,2005,124:285-294.

[16]Udall J,Swanson J,Haller K,etal.A global assembly of cotton ESTs[J].Genome Research,2006,16:441-450.

[17]Qi J L,Zhang W J,Liu S H,etal.Expression analysis of light-regulated genes isolated from a full-length-enriched cDNA library ofOnosmapaniculatumcell cultures[J].Journal of Plant Physiology,2008,165:1474-1482.

[18]Haas B J,Volfovsky N,Town C D,etal.Full-length messenger RNA sequences greatly improve genome annotation[J].Genome Biology,2002,3(6):research0029.1-research0029.12.

[19]Carninci P,Shibata Y,Hayatsu N,etal.Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes[J].Genome Research,2000,10:1617-1630.

[20]Wellenreuther R,Schupp I,The German cDNA Consortium,etal.SMART amplification combined with cDNA size fractionation in order to obtain large full-length clones[J].BMC Genomics,2004,5:36.

[21]李冬花,姚麗娟,余有本,等.特異茶樹種質紫陽1號cDNA文庫構建及ESTs初步分析[J].安徽農業大學學報,2009,36(3):347-350.

[22]郭海林,鄭軼琦,陳宣,等.結縷草屬植物種間關系和遺傳多樣性的SRAP標記分析[J].草業學報,2009,18(5):201-210.

[23]陳宣,郭海林,薛丹丹,等.結縷草屬植物耐鹽性SRAP分子標記研究[J].草業學報,2009,18(2):66-75.

[24]陳宣,薛丹丹,郭海林,等.結縷草屬植物RAPD反應體系的優化[J].草地學報,2009,17(2):181-186.

[25]薛丹丹,郭海林,鄭軼琦,等.結縷草屬植物雜交后代雜種真實性鑒定——SRAP分子標記[J].草業學報,2009,18(1):72-79.

[26]劉志偉,張智俊,韓國民,等.毛竹筍全長cDNA文庫構建[J].生物技術通報,2010(2):98-101.

[27]張翅,戴國飛,劉軍立,等.鹽脅迫下杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)cDNA文庫的構建與新表達序列標簽(EST)的獲取、分析[J].武漢大學學報(理學版),2009,55(3):348-353.

[28]王麗娟,金治平,王能飛,等.羊草葉片cDNA文庫的構建及部分表達序列標簽的分析[J].草業學報,2009,18(1):65-71.

[29]Li F,Jin Z,Qu W,etal.Cloning of a cDNA encoding theSaussureamedusachalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco[J].Plant Physiology and Biochemistry,2006,44:455-461.

[30]Tan W,Chen Y,Zhang L,etal.Construction and characterization of a cDNA library from liver tissue of Chinese banna minipig inbred line[J].Transplantation Proceedings,2006,38:2264-2266.

[31]Tian B,Lin Z B,Ding Y,etal.Cloning and characterization of a cDNA encoding Ran binding protein from wheat[J].DNA Sequence:The Journal of Mapping,Sequencing and Analysis,2006,17:136-142.

[32]Sambrook J,Russell D W.分子克隆實驗指南[M].第3版.黃培堂,譯.北京:科學出版社,2002:857-914.

[33]Ramani B,Reeck T,Debez A,etal.AstertripoliumL.andSesuviumportulacastrumL.：Two halophytes,two strategies to survive in saline habitats[J].Plant Physiology and Biochemistry,2006,44:395-408.

[34]Clarke L,Carbon J.A colony bank containing synthetic CoI EI hybrid plasmids representative of the entireE.coligenome[J].Cell,1976,9:91-99.

[35]張震,王教瑜,杜新法,等.稻曲病菌cDNA文庫的構建[J].植物病理學報,2008,38(5):462-467.

[36]盧圣棟.現代分子生物學實驗技術[M].第2版.北京:中國協和醫科大學出版社,1999:338-339.

[37]吳東,劉俊杰,喻樹迅,等.中棉所36均一化全長cDNA文庫的構建與鑒定[J].作物學報,2009,35(4):602-607.

[38]Sterky F,Regan S,Karlsson J,etal.Gene discovery in the wood-forming tissues of poplar:Analysis of 5,692 expressed sequence tags[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,1998,95:13330-13335.

[39]Lange B M,Wildung M R,Stauber E J,etal.Probing essential oil biosynthesis and secretion by functional evaluation of expressed sequence tags from mint glandular trichomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,2000,97:2934-2939.

[40]Sugui J A,Deising H B.Isolation of infection-specific sequence tags expressed during early stages of maize anthracnose disease development[J].Molecular Plant Pathology,2002,3:197-203.