大骨節病患者與健康人軟骨細胞轉化生長因子-β mRN A的表達差異

李若飛,高大龍,涂忠民,楊雷剛,董舒,任軍龍,解俊杰,趙昕

(陜西省咸陽市中心醫院骨一科,陜西 咸陽 712000)

大骨節病(kaschin-bick disease,KBD)是一種病因不明的地方性慢性骨關節病,起病隱匿。中國國內又叫矮人病、算盤珠病等,國際醫學界稱本病為 Kaschin-Beck病。大骨節病在國外主要分布于西伯利亞東部和朝鮮北部,在中國分布范圍大,從東北到西南的廣大地區均有報道,主要發生于黑、吉、遼、陜、晉等省,多分布于山區和半山區,平原少見。本病在各個年齡組都有發生,但多發于兒童和青少年,成人很少發病,無明顯的性別差異。本病常常多發性、對稱性侵犯軟骨內成骨型骨骼,導致軟骨內成骨障礙、管狀骨變短和繼發的變形性關節病。臨床表現為關節疼痛、增粗變形,肌肉萎縮,運動障礙[1,2]。其主要特征是青少年發育過程中軟骨內化骨型的透明軟骨發生多發性灶狀軟骨壞死,并導致軟骨內化骨障礙和繼發性骨關節病。病理學研究發現,大骨節病屬于軟骨營養不良性變化,包括軟骨萎縮、變性和壞死的病理過程,同時出現修復性適應性變化,導致軟骨內骨化型的透明軟骨(骺軟骨、骺板軟骨和關節軟骨)發生多發性灶狀壞死及繼發性骨關節病。

轉化生長因 子 -β(transform growth factor β ,TGF-β )是一大類調節細胞生長分化的因子,在許多器官或組織的生長和分化中起著重要的作用[3-5]。現已證實,TGF-β在軟骨發育過程中有提高硫酸化蛋白多糖、膠原、軟骨連接蛋白及堿性磷酸酶活性的作用。在軟骨細胞分化早期,促進未分化的間充質細胞形成軟骨[6],但抑制終末細胞的肥大、分化及基質礦化。其作用可以通過作用于細胞核的途徑來進行[7]。有學者提出 TGF-β受體對 TGF-β反應性的喪失可促進小鼠軟骨細胞的終末分化并導致類似于人類骨關節病的發展[8]。大骨節病晚期也有明顯的骨關節病改變,而大骨節病軟骨 TGF-β基因水平表達方面的研究未見報道。因此,本實驗對這方面進行了初步的探索,以進一步闡明大骨節病的發病機理。

1 材料與試劑

1.1 時間地點 本實驗在 2009年 12月至 2011年2月在西安交通大學醫學院生物醫學研究實驗中心完成。

1.2 對象 大骨節病和正常對照關節軟骨標本各 5例。大骨節病關節軟骨取自咸陽市第二人民醫院對大骨節病患者實施膝關節清理術后的關節軟骨,其中男 3例 ,女 2例,年齡39～57歲。正常組軟骨標本取自于咸陽市中心醫院因車禍等意外原因所致關節骨折手術所取軟骨,其中男3例,女2例,年齡28～54歲。納入標準:a)大骨節病標本符合國內大骨節病臨床診斷標準(GB16003-1995)診斷。b)兩組標本軟骨均取自膝關節。 c)根據國務院《醫療機構管理條例》規定 ,患者或家屬對標本收集及用途均知情同意。排除標準:遺傳性、退行性骨關節炎和類風濕性關節炎。

1.3 主要試劑 DNA marker購自 Takara公司;DN A凝膠回收試劑盒購自 Omega公司;細胞總 RN A提取試劑盒、cDN A合成試劑盒購自M BI公司;引物合成及基因測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成;其他生物化學試劑和耗材購自西安潤德生物工程公司。

2 方法與步驟

2.1 提取軟骨細胞總 RNA 選擇 5位 KBD患者和5位健康人的軟骨組織,按照 FAST200總 RNA提取試劑盒操作,得到5種總RNA,分別命名為 RN A-K1/2/3/4/5和 RN A-N1/2/3/4/5。總 RNA提取步驟(以 1個樣本為例):a)樣品預處理:將軟骨研碎,胰酶消化細胞后,留下細胞團塊和適量上清(2×106細胞/100μL),充分震蕩致細胞團塊松散,放入新的無菌無酶的eppendorf管中。b)處理好的樣品中加入RA2液500 μL,充分顛倒 1 min。 c)將樣品裂解物倒入或吸入內套管,4℃、12000 rpm離心1 min。d)棄外套管內液體,內套管中加入 500μL洗液,4℃、12000rpm離心 1min。e)重復上步驟條件洗滌一次。f)棄外套管內液體,內套管中不加入洗液,4℃、12000 rpm離心 1 min。g)將內套管放入新的無菌無酶的eppendorf管 ,在膜中央加入 25μL洗脫液。室溫靜置1min,離心 1min,得到 25μL總 RN A。

2.2 逆轉錄合成cDNA 分別以10份軟骨細胞所提取的總RN A為模板,用 MBI逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應,得到10種 cDNA產物,命名為 RT-K1/2/3/4/5和 RT-N1/2/3/4/5。逆轉錄反應操作步驟 (以1個樣本為例):a)0.2mL無菌無酶的 PCR反應管中依次加入 5μL總 RNA、1 μL Random hexamer primer和6μL Depc-H2O,共12μL體系。混勻離心,70℃反 應 5min。 b)加 入 4 μL5× reaction buffer、 2μL dNTPmix和1μL Ribolock,共 19μL體系。混勻離心,25℃反應 5 min。c)加入 1μL M-Mμlv。混勻離心,25℃反應 10 min,42℃反應 60min,70℃反應 10min,得到 20μLcDNA產物。

2.3 引物設計與合成 根據 Genebank查詢得到人 TGF-β的基因序列,其 Gene ID為NM-000660。設計針對 TGF-B基因的特異引物 ,擴增基因片段位于 TGF基因的981～1230,大小為250bp。同時設計 1對針對人β-actin的引物,作為內參,擴增基因片段大小為146 bp。將設計好的引物序列交由上海生工生物公司合成。TGF-β引物序列如下。上游 TGF-P1:5′-CAAGACT ATCGACATGGAGC-3′; 下 游 TGF-P2:5′-GGTT TCCACCATT ACACGC-3′。β-actin引物序列如下。上游 actin-P1:5′-CTATCGGCAATGAGCGGT TCC-3′;下 游actin-P2:5′-TGTGT TGGCATAGAGGTCTTT ACG-3′

2.4 Pcr擴增TGF-β基因 選擇西安潤德生物公司生產的2× PCR Mix反應體系。以10份軟骨細胞所提取的總 RN A逆轉錄得到的 cDNA為模板,利用特異引物 actin-P1/P2和TGF-P1/P2擴增目的基因,得到 10種actin和10種 TGF-β的PCR產物。分別命名為 PCR actin-K1/2/3/4/5、PCR TGFK1/2/3/4/5、PCR actin-N1/2/3/4/5和 PCR TGF-N1/2/3/4/5。

反應體系為(50μL):PCR Mix25μL,上下游引物 P1、P2各 1μL,cDNA 2μL,ddH2O 21μL。 反應條件:預熱 94℃5 min,循環 94℃ 30 sec、55℃ 30 sec、 72℃ 30 sec(35 cycles),后延伸 72℃ 3min。

2.5 瓊脂糖凝膠電泳以及圖像分析 取20種RT-PCR產物各5μL,分別加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔內,以100 bp DNA marker作為參照。直流電 100V電泳 30 min。在紫外燈下觀測電泳條帶位置并照像。利用圖像處理軟件分析各條帶灰度。

2.6 統計學處理 應用統計學軟件 SPSS 13.0進行數據分析,采用t檢驗進行統計學檢驗,設定P＜0.05認為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 RT-PCR電泳圖像 見圖1～2。

3.2 圖像分析測定mRN A表達差異 利用圖像處理軟件分析 RT-PCR各條帶灰度,以β-actin為參照,計算相對灰度值,如圖3所示,可見大骨節病患者軟骨細胞的 TGF-β表達低于健康成人。

大骨節病患者 TGF-β RT-PCR相對灰度值為 0.8262±0.0361,健康成人為1.3628±0.1011,用 SPSS 13.0進行統計學分析,采用t檢驗分析t=11.1732,差異具有統計學意義(P ＜0.05)。

圖1 大骨節病患者軟骨細胞 RT-PCR電泳圖像

圖2 健康人軟骨細胞 RT-PCR電泳圖像

圖3 不同個體軟骨細胞 TGF-β表達的變化

4 討 論

大骨節病是一種原因不明的地方性骨關節性疾病。在我國、前蘇聯、日本、朝鮮等國均有該病的報道。 KBD的病因說之一即是生物地球化學說[9,10],它指的是外環境水、土、糧低硒,但是環境低硒不是其特異性致病因子,多項研究表明是多種細胞因子的共同作用。以往研究表明,炎癥細胞因子在骨關節病的發病中具有重要的作用。如白細胞介素-1可誘發關節炎癥和關節翳的形成,也可通過 RAN K/RAN KL破壞骨和軟骨。腫瘤壞死因子通過上調血管內皮細胞黏附因子-1的表達,可誘導核因子κ B活化。關節滑膜中的腫瘤壞死因子可活化內皮細胞,刺激纖維母細胞分化,并可誘導金屬蛋白酶以及白細胞介素-1、白細胞介素-6等的產生,以及通過白細胞介素-1間接引起組織的損傷[11-14]。白細胞介素-1、TNF在軟骨損傷過程中,可激活基質降解酶,促進軟骨基質分解,刺激關節局部炎性、免疫反應。

轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)家族包括結構相似而功能不同的五個多肽成員,有激動劑、抑制劑和苗勒管抑制物質等。大多數的哺乳動物細胞都具有分泌TGF的功能。在體內,大多數的細胞都可表達 TGF受體(TGF-R)[15]。 TGF-β是 TGF家族成員之一,是一種二聚體多肽,具有多種生物功能。研究表明,TGF廣泛參與體內各種病理生理過程,對細胞的增殖與分化、細胞外基質的產生、創傷愈合、胚胎發育、血管生成、纖維化、細胞凋亡及機體免疫系統均有著重要作用[16]。

轉化生長因子β(tromsforming growth factor-β,TGF-β)是一種多肽、廣泛存在于正常組織中,尤其以骨組織中含量最為豐富,TGF-β在調節骨代謝、骨改建過程中發揮重要作用,它調節多種細胞如成骨細胞、破骨細胞的增殖和分化,并影響骨基質合成[17]。大骨節病患者發病多始于兒童期,在成人表現明顯。其發病與骨關節炎有相似之處。在骨細胞的分化生長中,需要轉化生長因子的調節。而大骨節病的骨細胞分化顯然是存在障礙的。這與轉化生長因子的缺乏存在一定的關系。 TGF-β在體內沒有明顯骨誘導作用,但體外實驗表明 TGF-β能夠刺激體外培養的骨祖細胞增殖,能夠促進骨髓基質細胞的成骨分化[18]。在成骨細胞上分布著高親和力的TGF-β 受體,受 TGF-β的刺激后,可合成大量基質。 TGF-β最初刺激成纖維細胞和成骨細胞的有絲分裂,使其增殖分化為成骨細胞,增加骨鈣含量。

從大骨節病的表現看,其主要累及關節軟骨、骨骺端的生長發育,病理表現為透明軟骨變性壞死。既往的研究表明,軟骨細胞和骨細胞的成熟分化過程中,需要包括轉化生長因子在內的眾多細胞因子的參與和調節。TGF-β能夠促進骨及軟骨分化、改建等過程。大骨節病患者軟骨細胞中細胞因子的缺乏,與其發病存在一定的聯系。在基因水平,TGF-β的表達在健康人和大骨節病患者中的差異,需要用實驗去驗證。

本實驗從 mRNA水平驗證了 TGF-β在大骨節病患者和健康人軟骨中的表達是不同的。大骨節病患者軟骨中TGF-β的表達低于健康人群。在正常軟骨發生過程中,TGF-β1,TGF-β 2,TGF-β 3在軟骨細胞的表層,過渡層及成熟度很低的細胞層中表達強烈。大骨節病病理改變主要表現為深層軟骨細胞的壞死,這提示隨著壞死細胞的增多,TGF-β的表達減弱。有文獻報道,TGF-β可通過增強軟骨細胞的增殖,誘導軟骨細胞合成的活性等一系列作用參與軟骨修復過程。這一結論的得出,為我們下一步研究大骨節病的發病機制,進而為治療大骨節病奠定了基礎。

本研究的缺點之一在于病例數偏少,難以覆蓋大樣本人群,在以后的研究中,將盡可能擴大樣本量,以減少偏倚;另一缺點在于未能從蛋白水平加以驗證,這將是下一步研究的目標和重點工作。

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