食物致病菌快速檢測系統的設計與實現*

許 麗，董文鈞，王學斌，陳本永

(浙江理工大學納米測量技術實驗室，杭州310018)

傳統的細菌檢測方法仍然停留在細菌培養和用標準菌落計數器或其它的照明放大鏡計數的基礎上，傳統方法檢測起來不僅繁瑣，而且檢測周期較長，約為24 h～48 h，難于滿足目前對食品安全監測的要求［1］?；诳乖贵w相互作用的免疫傳感器由于其特異性和靈敏性使其成為研究的熱點，通過抗原－抗體的相互作用，幾乎所有的微生物可以直接或間接地被快速檢測出來［2－9］。免疫傳感器就其檢測方法又可分為:電流檢測法［2，4］、循環伏安法［3］、阻抗頻譜法［5－6］、生物發光法［7］。其中阻抗頻譜法具有檢測速度快、無標記、信息量全面、成本低、易于操作等特點被廣泛地應用于微生物免疫分析領域。免疫傳感器按固定抗體的方法可以分為:生物素－(鏈霉)親和素相互作用法［3，7］、導電聚合物包埋法［4，6］、自組裝單層膜吸附法［5，8］、蛋白質A或G特異結合法［9］。生物素－親和素相互作用法需要將捕獲抗體進行生物素化修飾，蛋白質特異結合法只能針對少量種類細菌抗體，本文采用TiO2納米線的物理吸附作用來固定抗體。

TiO2具有良好的生物相容性、化學穩定性和可忽略的蛋白質變性作用，這些特殊的性能都使其成為理想的生物傳感材料［10］。由于二氧化鈦納米線與其它形態的二氧化鈦相比，具有更大的比表面積和更強的吸附能力［11］。因此采用化學方法合成TiO2納米線，半導體特性的TiO2納米線上可以固定單克隆抗體，單克隆抗體能夠與目標靶細菌特異性結合，導致TiO2納米線的阻抗發生變化，可制備微生物免疫傳感器［12］。本文基于TiO2納米線束和電化學阻抗譜法設計了一套食物細菌自動檢測一體化系統。以致病性大腸桿菌為例進行檢測，實驗結果表明，該檢測系統的傳感器具有較低的檢測下限和較好的復用性，與常規方法相比大大縮短了檢測周期，且易于操作和使用。

1 食物致病菌快速檢測系統的設計與實現

本文設計的食物致病菌快速檢測一體化系統如圖1所示，主要是由步進電機、直流電機、蠕動泵頭、傳感器、檢測控制電路和計算機組成。為了實現精確進樣，本系統采用57型步進電機裝上DG型蠕動泵頭，再加上內徑和管壁尺寸都為1 mm的Viton抗腐蝕微細軟管，可以對試劑實現分辨率為0.01 μL的注射。在試驗中為了節約樣本試劑，在微細軟管的末端裝有注射頭，先將注射頭插入樣本試劑液面下2 mm，控制步進電機倒轉吸入試劑，然后將注射頭移至傳感器，控制步進電機正轉排出試劑。而對于傳感器納米線束的自動清洗不需要很高的精度要求，可以使用直流電機裝上102K型蠕動泵頭，軟管采用內徑和管壁尺寸分別為2 mm和1 mm的Viton抗腐蝕微細軟管。計算機作為上位機運行應用程序，采用圖形化操作界面控制整個系統的運作。

圖1 食物致病菌一體化檢測系統框圖

1.1 基于TiO2納米線的微生物免疫傳感器的工作原理

利用TiO2納米線束對目標細菌進行檢測的原理如圖2所示，傳感器兩金電極之間的TiO2納米線束的阻抗和金電極的阻抗為被測物理量，金電極的阻抗相對于半導體特性的TiO2納米線束的阻抗來說極小，完全可以忽略。TiO2納米線束具有很大的比表面積，可以牢牢地吸附住抗體，為了防止金電極和抗體相接觸進而改變金電極的阻抗，傳感器先用硫醇處理金電極，使其不能與抗體抗原相接觸。然后加入單克隆抗體，使其固定于TiO2納米線束表面，最后加入目標細菌，TiO2納米線束上的單克隆抗體和目標靶細菌進行特異性免疫結合，從而使二氧化鈦－抗體－細菌組成的復合納米線束的阻抗發生變化。通過測量復合納米線束阻抗的變化量，反推即可得知樣本中所含目標靶細菌的數量。

圖2 利用TiO2納米線束微電極檢測細菌的示意圖

1.2 TiO2納米線的制備

制備方法采用典型的水熱法并加以改進，通過控制反應溫度來制備TiO2納米線。將1.0g銳鈦礦TiO2粉末放入20mL二次去離子水中，超聲30 min形成TiO2懸濁液，再將懸濁液加入盛有20 mL NaOH(10 mL/L)溶液的具有四氟乙烯內襯的高壓釜中反應，反應溫度控制在150℃ ～180℃，反應時間控制在12 h ～72 h［13］。反應結束后，用 10%(質量分數)鹽酸將反應液pH值調至中性，邊過濾邊用二次去離子水清洗，直至無 Cl－(用 AgNO3鑒定Cl－)。經過濾后，將得到的沉積物在氮氣的氣氛下干燥，最后得到的白色產物是具有大比表面積和強吸附能力的多層次結構TiO2納米線。

1.3 傳感器的實現

將TiO2納米線束置于氧化硅基片上，用微米級的銅網對納米線做掩膜。使用JPC－1600離子濺射儀對掩膜后的納米線基片進行鍍金形成金電極，保證金電極與納米線垂直，去掉銅掩膜，選擇相鄰的兩個平行金電極做為連接電極，其余金電極用刀片刮除。用帶有絕緣外皮的漆包銅絲焊接到金電極上，焊接處和金電極的大部用絕緣膠將其封裝，銅絲做為導線與外界連接。采用3－巰基丙酸來修飾沒有被絕緣膠封裝的少部分金電極，阻止金電極與抗體相接觸，最后分別用99.5%乙醇和二次去離子水清洗3次。

制備的TiO2納米線金電極的光學顯微鏡照片如圖3所示，相鄰金電極之間距離約為30 μm，每個金電極寬約100 μm，TiO2納米線束長達1 mm～5 mm，TiO2納米線束的直徑約為1 μm ～20 μm。

圖3 TiO2納米線金電極

1.4 檢測控制電路的設計

如圖1所示，系統的檢測控制電路包括六個模塊:單片機、阻抗檢測模塊、串行通信模塊、步進電機驅動模塊、直流電機驅動模塊、電源模塊。硬件電路的核心任務是測量出微生物免疫傳感器中固定了抗體的二氧化鈦納米線束在捕獲目標靶細菌前后阻抗的變化量，因此，檢測控制電路設計的核心是阻抗檢測模塊，其測量出來的阻抗信息經單片機和串行通信模塊傳送到PC機上顯示。

阻抗檢測模塊采用美國AD公司的高集成度的阻抗檢測芯片AD5933。片上集成了直接數字頻率合成器和12 bit、1MSPS的模數轉換器。如圖4所示，直接數字頻率合成器DDS可以產生任意指定頻率的正弦交流激勵信號，然后通過前置放大器施加于傳感器上。對經過傳感器調制的響應信號進行放大、濾波后，ADC進行采樣，然后由DSP引擎進行離散傅里葉變換(DFT)處理。DFT算法在每個頻率點上計算出阻抗的一個實部(R)數據字和一個虛部(I)數據字。實部數據字和虛部數據字保存在對應的片上寄存器內，寄存器內容可以通過I2C總線從片上串行I2C接口讀取。圖1中SDA和SCL為串行I2C總線，VOUT是正弦激勵信號輸出端，VIN是阻抗信息檢測信號輸入端。

圖4 阻抗檢測模塊框架圖

單片機通過步進電機驅動模塊來驅動步進電機，57型步進電機57BYHB76－03A的工作電壓為12 V，額定電流為3 A，由于單片機的驅動能力有限，因此采用光耦PC817、達林頓功率晶體管TIP122和大功率限流電阻10 W 3 Ω組成步進電機驅動模塊，控制DG型蠕動泵頭的開啟、停止、正反轉、轉動步數，實現了試劑的精確化進樣。另外，單片機通過由光耦和可調限流電阻組成的直流電機驅動模塊控制裝有102K型蠕動泵頭的直流電機ZGA28RO147轉動，實現傳感器的自動清洗。

1.5 程序設計

檢測系統采用上下位機的設計方法，由上位機通過串口向下位機發送控制命令，下位單片機執行相應的控制命令并把采樣結果通過串口傳送給上位機PC。

由于阻抗檢測芯片AD5933需要I2C總線而下位機沒有專用的I2C總線接口，本系統在單片機的通用輸入輸出引腳中選取兩個引腳采用軟件時序模擬的方法實現I2C總線的接口功能。下位機采用輪詢的方式接收來自上位機的命令，主要執行模塊分為阻抗測量模塊和電機控制模塊，具體的阻抗測量模塊程序流程如圖5所示。上位機的用戶控制應用程序采用Visual Basic 6.0編譯環境來實現，具體實驗控制界面如圖6所示。

圖5 下位機程序阻抗測量模塊流程圖

圖6 上位機實驗控制界面

2 實驗

2.1 試劑

TiO2粉末(Degussa P25)、氫氧化鈉、鹽酸、3－巰基丙酸(99%)、99.5%乙醇和甘露醇，以上試劑均為分析純級別，購自杭州高晶精細化工有限公司。10 mol/mL 的磷酸鹽緩沖液(自配，PBS，pH=7.4)，致病性大腸細菌(Enteropathogenic E.Coli，EPEC，上海譜振生物有限公司)，致病性大腸桿菌抗體(bs－0658R，上海譜振生物有限公司)，營養肉湯，麥康凱瓊脂(杭州微生物試劑有限公司)。實驗用水均為二次去離子水。

2.2 細菌準備和平板計數

將購置的大腸桿菌用普通的營養肉湯在37℃條件下培養16 h～20 h，然后用pH=7.4的PBS緩沖溶液將高濃度大腸桿菌溶液依次稀釋成6個濃度梯度，分別裝入 6 個小瓶，從 10－1到 10－6，每瓶 10 mL，分別標號1～6。用傳統的平板計數法對各濃度溶液計數。

2.3 實驗過程

檢測細菌的基本步驟如下:第1步，將3－巰基丙酸修飾后的傳感器接入檢測系統，點擊采樣按鈕，測量其阻抗頻譜。第2步，安裝注射頭，點擊吸取、進樣按鈕，控制蠕動泵將10 μL致病性大腸桿菌抗體滴在TiO2納米線束表面上，在室溫培養2 h，然后點擊沖洗按鈕用去離子水沖洗，最后點擊采樣按鈕，測量固定抗體后傳感器的阻抗頻譜。第3步，換注射頭，點擊吸取、進樣按鈕，控制蠕動泵將10 μL致病性大腸桿菌(EPEC)滴在TiO2納米線束表面上，在室溫培養50 min，然后點擊沖洗按鈕用去離子水沖洗，最后點擊采樣按鈕，測量加入細菌后傳感器的阻抗頻譜。第4步，把使用過的傳感器置入蛋白質去垢劑中清洗，去除納米線固定的抗體－抗原復合物，然后干燥備以后使用。

為了測試檢測系統中傳感器的復用性，取同一濃度的大腸桿菌溶液，對同一個傳感器重復上述基本檢測步驟3次。

1號～6號小瓶大腸桿菌溶液濃度，由平板計數得分別為:4.5×106cfu/mL、4.5×105cfu/mL、4.5×104cfu/mL、4.5×103cfu/mL、4.5×102cfu/mL、4.5×101cfu/mL。分別從1號～6號小瓶中取10 μL致病性大腸桿菌用自制檢測系統進行檢測。

3 實驗結果分析

為了驗證致病性大腸桿菌被抗體修飾的TiO2納米線所捕獲，對納米線在細菌被捕獲前后的掃描電子顯微鏡圖片進行比較，如圖7所示，可以看出，表面固定有抗體的納米線在加入致病性大腸桿菌后，致病性大腸桿菌被吸附在納米線的表面，被捕獲的細菌大小約為2.0 μm，這與致病性大腸桿菌的大小相匹配。

圖7 TiO2納米線捕獲致病性大腸桿菌后的SEM圖片(插圖為捕獲前的SEM圖)

首先用自制的檢測系統對沒有固定抗體的傳感器測試，然后對傳感器固定抗體并測試，最后加入細菌待傳感器捕獲細菌后對其測試，這3個不同階段測試所得的傳感器阻抗譜如圖8所示。從阻抗譜中可以看出，在10 000 Hz之前3個階段的阻抗差異較為明顯，驗證了本檢測系統的可用性，能夠檢測到細菌的存在。當抗體滴加在TiO2納米線上后，納米線的阻抗值有明顯的下降，而大腸桿菌加入后納米線的阻抗值又有明顯的上升，這是因為在中低頻率下TiO2納米線的阻抗主要是由TiO2的極化所引起的。在0.1 mol/L的甘露醇溶液中(PH≈7)，TiO2納米線表面帶有負電荷，而致病性大腸桿菌抗體帶有正電荷，致病性大腸桿菌帶有負電荷。當抗體滴加在納米線表面時，帶正電的抗體與帶負電的納米線發生靜電吸引，使得抗體被牢牢地吸附在納米線表面，從而導致納米線表面凈負電荷量減少，引起納米線的阻抗值下降。而當大腸桿菌滴加在納米線表面時，細菌與納米線固定的抗體發生特異性反應而被抗體捕獲，同時帶負電荷大腸桿菌的加入使得納米線表面凈負電荷量比抗體固定后有所增加，從而引起TiO2納米線阻抗值的增加。

圖8 納米線傳感器三個不同階段的阻抗譜

從圖9可以看出掃描頻率在1 000 Hz～10 000 Hz之間時自制檢測系統(主要是TiO2納米線傳感器)的阻抗值基本重合，由此可知制作的傳感器重復性較好，可以反復多次使用。

圖9 用同一傳感器對同一濃度的大腸桿菌檢測3次的阻抗譜

從1號～6號小瓶中分別取10μL濃度為4.5×106cfu/mL～4.5×101cfu/mL 的致病性大腸桿菌進行檢測，結果如圖10所示?？梢悦黠@看出隨著細菌濃度的下降對應的阻抗譜也在下降，當細菌濃度下降到4.5×101cfu/mL時，對應的阻抗譜已經與固定抗體后納米線的阻抗譜難于區分，所以該傳感器的檢測下限為 4.5×102cfu/mL。

圖10 加入不同濃度致病性大腸桿菌時的阻抗譜

為了研究免疫傳感器捕獲細菌后的阻抗值與細菌濃度的關系，在掃描頻率為1 040 Hz下，取大腸桿菌不同濃度4.5×102cfu/mL ～4.5×106cfu/mL 的對數值(logC)及其對應的傳感器阻抗值作圖，并將其做線性回歸擬合，擬合直線見圖11。擬合后的直線方程為:y=302 687logC－533 666，其中y為傳感器的阻抗值，相關系數R=0.93365。

圖11 大腸桿菌濃度的對數值與其對應的阻抗值的線性擬合

4 結論

本文設計并研制了基于TiO2納米線束微生物免疫傳感器的食物致病菌快速檢測一體化系統，對檢測系統的硬件電路和上下位機軟件程序進行了構建和實現，以大腸桿菌為例對系統進行測試實驗，實驗結果表明該系統可以快速檢測出食物中大腸桿菌的存在，檢測周期約為1 h，并驗證了傳感器的復用性，表明傳感器可以多次重復使用。通過對細菌溶液梯度稀釋檢測，得出傳感器的檢測下限為4.5×102cfu/mL。在1 040 Hz掃描頻率下，取大腸桿菌不同濃度的對數值及其對應的傳感器阻抗值做線性回歸擬合，但線性相關系數不是很高。

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