廖 立，楊小紅，金 巖

骨質疏松是最常見的三大老年性疾病之一，嚴重危害老年人群的身體健康。其發病機制不一，包括遺傳性、廢用性、代謝異常、退行性、激素水平異常、藥物因素等［1］，其中，絕經后雌激素缺乏導致的骨質疏松在其中占據了很大一部分，＞50歲女性因骨質疏松導致骨折的風險＞20%［2］。相關的機制研究過去主要集中于破骨細胞的異?；罨希罅垦芯勘砻?，雌激素缺乏可以通過核因子活化因子受體及其配體(RANKL/RANK)途徑刺激破骨前體細胞向破骨細胞的轉化［3－4］;還能夠直接導致破骨細胞和成骨細胞中凋亡相關因子配體(FasL)表達下降，使破骨細胞凋亡下降，延長存活時間［5］。但是，近年來不少學者提出，骨改建是一個成骨與破骨動態平衡的過程，成骨及破骨的失衡才是骨質疏松發生的根本原因［6］。干細胞作為各種組織細胞的來源，在維持組織的新陳代謝和穩態中發揮了重要作用，越來越多的研究提出，干細胞功能障礙與許多疾病的發生密切相關，特別是衰老等退行性變中作用明顯［7］。骨髓間充質干細胞(BMMSC)作為成骨細胞的前體細胞，其在骨骼發育與重建的過程中的作用逐漸受到重視。研究發現［8－9］，BMMSC成骨和成脂分化的失調會導致骨質疏松或者骨量過高;二聚糖基因(Biglycan)敲除導致小鼠成骨祖細胞凋亡增加和增殖減弱，導致進行性的骨質疏松［10］;細胞凋亡蛋白酶3(caspase3)抑制劑能夠通過影響BMMSC的分化而加速骨質疏松的發生過程［11］;活化的T細胞可以通過凋亡相關因子及其配體(Fas/FasL)通路導致BMMSC的凋亡而促進骨質疏松［12］;老年人群的BMMSC的增殖及分化功能均有減退，與骨質疏松的表現相一致［13］。這些實驗證明了BMMSC功能和數量的異常將導致骨骼發育和骨改建的異常。但是對于雌激素缺乏如何導致BMMSC的功能失調仍尚不明確。在本研究中，我們通過建立去勢小鼠骨質疏松動物模型，提取BMMSC進行體外培養和功能檢測，明確其內源性的增殖及分化功能改變，并采用檢測關鍵基因表達水平和microRNA表達譜分析，從分子水平探索其生物學行為變化的原因。

材料與方法

1 卵巢切除組(OVX)小鼠骨質疏松模型的建立

取8周齡C57小鼠40只，隨機分為OVX組和假手術組(Sham)組，每組20只。OVX組以1%戊巴比妥鈉麻醉后，從背部開口尋找到雙側卵巢，于子宮頸部結扎后切除卵巢，縫合傷口。Sham組尋找到卵巢后僅切除部分脂肪組織，縫合傷口。置于無特定病原體(SPF)級動物房飼養，自由進食水3個月后取雙側股骨進行組織學檢測。

2 組織學檢測

取小鼠雙側脛骨及股骨，多聚甲醛固定4h后置于10%乙二胺四乙酸(EDTA)內脫鈣10d，隔天換液。流水沖洗過夜后石蠟包埋，常規切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察并照相。

3 BMMSC體外培養

小鼠BMMSC的體外培養參照以往的方法。小鼠頸椎脫臼后剝取股骨及脛骨，剔除表面肌肉及軟組織，以1ml針管沖洗骨髓后接種于含10%胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)的α-最小必須培養基(α-MEM)內，37℃、5%CO2培養箱常規培養。每2天半量換液，當密度達到80%后以2×104/cm2的密度傳代。

4 生長曲線

采用P3代的小鼠細胞以5×104每孔分別接種于12孔板中，接種后2、4、6、8、10、12、14、16d以胰酶消化后計數。

5 成骨誘導及檢測

成骨誘導液配方為α-MEM，加入10% FBS，100nmol/L地塞米松，5mmol/L甘油磷酸鈉和50μg/ml左旋維生素C(Sigma公司)。細胞按照2×105/孔接種于6孔板內，待密度達到85%以后加入成骨誘導液誘導21d。以4%甲醛固定后，采用茜素紅染色檢測成骨分化，并以10%西吡氯銨洗脫后用分光光度計檢測570nm光吸收值，行定量分析。

6 成脂誘導及檢測

成脂誘導液配方為α-MEM，加入10% FBS，0.5nmol/L異丁基甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma)，2μmol/L胰島素(Sigma)和10nmol/L地塞米松(Sigma)。細胞按照2×105/孔接種于6孔板內，待密度達到95%以后加入成脂誘導液誘導14d。以4%甲醛固定后，采用油紅染色檢測成脂分化，并以異丙醇洗脫后用分光光度計檢測520nm光吸收值，行定量分析。

7 microRNA芯片分析

取術后3個月OVX組及sham組小鼠各9只，取股骨及脛骨骨髓常規培養BMMSC，待原代細胞密度達到80%后分別提取RNA，質檢合格后以同組每3個RNA樣本等量混合，將得到的每組各3個混合RNA混合樣本行雙色microRNA微陣列芯片檢測(LC-μParafloTM微流體芯片，杭州聯川生物信息技術有限公司)。3張芯片的信號數據進行歸一化處理后，進行統計學分析。

結 果

1 C57小鼠骨質疏松模型的建立及鑒定

C57小鼠行雙側卵巢切除術后3個月，進行體重檢測，發現OVX組小鼠體重明顯重于Sham組。頸椎脫臼處死后，尸檢在OVX組內未發現卵巢，且子宮明顯萎縮;而Sham組具有正常的卵巢。取股骨遠端進行組織學檢測(圖1)，均顯示OVX組股骨遠端松質骨吸收明顯，骨小梁數量低于Sham組。同時發現干骺端生長板也較正常變薄，可能軟骨的形成和再生也受到了雌激素的影響。但是皮質骨厚度和結構沒有明顯變化，這與以往研究報道相一致，因為皮質骨的改建需要較長的時間。以上結果表明本實驗成功建立了OVX小鼠骨質疏松模型。

2 OVX小鼠中BMMSC的增殖能力下降，多向分化能力改變

將OVX組及Sham組小鼠BMMSC進行常規體外培養，取P3代細胞進行細胞增殖和多向分化能力檢測。結果 顯示，OVX組BMMSC體外擴增能力較Sham組有一定下降(圖2)。對BMMSC進行分化能力檢測，成骨誘導染色后鏡下可以觀察到OVX組形成的鈣化結節較Sham組少，染色淺(圖3、4);但成脂誘導時OVX組有更多的脂滴形成(圖5、6);定量檢測也證明了這些區別(P＜0.05)。證明OVX組BMMSC成骨分化能力要低于Sham組，而成脂分化能力則較強，與觀察到的組織學表現相一致。提示BMMSC的功能異常確實在骨質疏松的發病中發生了重要的作用。

3 OVX小鼠BMMSC的功能障礙受到多種方式調控

通過對OVX組和Sham組BMMSC中mRNA表達水平進行RT-PCR檢測(圖7)，發現與干細胞成骨成脂分化相關的關鍵調控基因如骨鈣素(OCN)、脂蛋白酯酶(LPL)和堿性磷酸酶(ALP)的表達發生了明顯的改變，其變化趨勢與細胞成骨成脂分化功能改變相一致，但Runt蛋白相關轉錄因子2(RUNX2)和過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-γ)這兩個在成骨成脂分化中發揮重要調控作用的關鍵基因在mRNA水平并沒有發生明顯改變，提示可能在轉錄后水平受到了調控。

通過對兩組BMMSC細胞RNA樣本進行microRNA微陣列芯片檢測，發現OVX組BMMSC的microRNA表達譜與Sham組相比發生了較明顯的改變。在BMMSC表達的339種已知microRNA中，有71種出現差異性表達，占所有表達microRNA的20.94%。其中，在OVX組中上調的microRNA為29種，而下調的microRNA為42種。倍數差異在4倍以上的microRNA有24種，占總microRNA的7.08%(表1)。以上數據表明，microRNA表達水平在OVX小鼠BMMSC中發生了較明顯的變化，可能在骨質疏松BMMSC中功能改變中發揮了重要的調控作用。

圖1 Sham及OVX組股骨遠端切片(箭頭標示為骨小梁結構)(HE×10倍)

圖2 兩種BMMSC生長曲線比較

圖3 兩種BMMSC成骨分化后形成的鈣化結節(茜素紅×100倍)

圖4 兩種BMMSC成骨分化定量分析

圖5 兩種BMMSC成脂分化后形成的脂滴(油紅 ×200倍)

圖6 兩種BMMSC成脂分化定量分析

圖7 兩種BMMSC基因表達RT-PCR結果

表1 芯片中差異性表達microRNA統計

討 論

實驗結果表明，在雌激素缺乏條件下，BMMSC在增殖及分化能力上都出現了一定的異常，并且此異常與骨質疏松中成骨能力下降的表型相一致，從而可能在骨質疏松的發生及發展過程中起到了一定的促進作用。有研究報道［1］，在骨質疏松發生早期，破骨細胞的過度活化發揮了主要作用，但隨著病情的發展，成骨功能的下降是導致后期骨質疏松加重的主要因素。我們的研究采用的是去勢后3個月的小鼠，從骨質吸收情況看，已經到達了中后期，此期BMMSC功能異常所導致的成骨功能缺陷可能發揮了更為重要的作用。在后續實驗中可以觀察去勢小鼠短期和長期BMMSC的生物學行為改變，并與中后期BMMSC相比較，從而觀察BMMSC在骨質疏松發病全程中的動態功能改變。

同時，我們觀察到，雖然造成去勢后骨質疏松的啟動因素是由于雌激素水平的下降，但是當OVX組BMMSC進行正常體外培養(含雌激素培養基)時，BMMSC功能缺陷在體外培養期間(30d左右)并沒有恢復，其增殖及分化能力中仍存在異常。一方面，因為BMMSC自身表達雌激素受體，受到雌激素的直接調控，可能是因為長期的激素缺乏可能對細胞造成一種“記憶效應”［14］，造成細胞難以短期逆轉的生物學行為改變，但是當雌激素水平恢復后能否完全逆轉或者多長時間能夠逆轉其功能改變將是一個有意義的課題，將為以后臨床作用于BMMSC治療的療效提供參考依據。另一方面，因為雌激素的靶點廣泛分布于全身各種組織和細胞中，雌激素水平的下降將引發全身一系列的改變，所以BMMSC也可能受到活化輔助性T細胞(Th)、繼發性激素改變、代謝改變等多種因素的共同作用，最終導致功能異常，所以單純體外恢復雌激素水平不能完全恢復其功能改變［15］。

因為干細胞的功能很大程度上由重要功能基因的轉錄來決定，所以我們對成骨分化相關的ALP、OCN、RUNX2以及成脂分化相關的LPL、PPAR-r等重要基因進行了RT-PCR檢測，發現ALP、OCN、LPL的表達改變與BMMSC的功能改變相一致，但是RUNX2以及PPAR-r的變化不明顯。由于近年來越來越多的研究發現了microRNA在基因的轉錄后調控中發揮了很重要的作用，所以骨質疏松狀態下的BMMSC功能缺陷不僅由基因轉錄失調所引起，也可能由microRNA表達譜及表達水平的改變所決定。microRNA微陣列芯片的結果也支持我們的推斷，約1/5的microRNA表達發生了改變。但是，因為microRNA具有1個microRNA調控多個靶基因或者1個靶基因受多個microRNA調控的特點，所以具體是哪些microRNA參與了重要分化相關基因的轉錄后調控，以及具體如何調控，還需要進一步的實驗驗證。

結論:本實驗證明了在雌激素缺乏所致骨質疏松中，BMMSC的增殖能力減弱，成骨能力減弱，而成脂能力增強，這些功能障礙可能在骨質疏松的發病中發揮了重要的作用。而BMMSC的功能障礙可能是由基因轉錄水平和轉錄后水平的調控異常所共同引起。

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