徐 競(jìng)，藍(lán) 丹，李 濤，楊光明，劉良明

嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管低反應(yīng)性(全身血管對(duì)縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低或不反應(yīng))，是血壓不能有效提升、組織灌注不良，細(xì)胞缺氧和損傷加重，最終導(dǎo)致多器官功能障礙(MODS)和多器官功能衰竭(MOF)的重要原因［1－2］。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生與血管平滑肌細(xì)胞鈣失敏有關(guān)［3］;缺血預(yù)適應(yīng)(5%失血量休克前30min預(yù)處理)可通過(guò)增高血管鈣敏感性誘導(dǎo)對(duì)失血性休克血管反應(yīng)性的保護(hù)效應(yīng)［4］。然而，在休克動(dòng)物，缺血預(yù)適應(yīng)能否通過(guò)恢復(fù)血管反應(yīng)性和鈣敏感性，改善血流動(dòng)力學(xué)，維持重要器官血流灌注和線粒體功能，從而對(duì)失血性休克大鼠起到保護(hù)作用，目前原理尚不清楚。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用失血性休克大鼠模型，觀察缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)休克復(fù)蘇大鼠存活時(shí)間、血管反應(yīng)性和鈣敏感性、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、肝腎重要器官的血流灌注和線粒體功能的影響，以闡明缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)失血性休克大鼠的保護(hù)作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)分組和大鼠處理

清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重200～230g，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，分作兩部分實(shí)驗(yàn):(1)取40只大鼠，觀察存活率及測(cè)定血管反應(yīng)性、鈣敏感性，隨機(jī)分為4組，每組10只。分為正常對(duì)照組、休克組(40mmHg休克2h，不復(fù)蘇)、乳酸格林液(LR)復(fù)蘇組(休克后用2倍失血量LR復(fù)蘇)、缺血預(yù)適應(yīng)組(5%失血量休克前30min預(yù)處理，再進(jìn)行失血性休克和2倍失血量LR復(fù)蘇)。右側(cè)股動(dòng)脈插管接血壓計(jì)，右側(cè)股靜脈插管進(jìn)行復(fù)蘇。(2)取20只大鼠，測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及肝腎血流量、線粒體功能，隨機(jī)分為2組，每組10只。分為L(zhǎng)R復(fù)蘇組(休克后用2倍失血量LR復(fù)蘇)、缺血預(yù)適應(yīng)組(5%失血量休克前30min預(yù)處理，再進(jìn)行失血性休克和2倍失血量LR復(fù)蘇)。右側(cè)股動(dòng)脈插管接血壓計(jì)，右側(cè)股靜脈插管進(jìn)行復(fù)蘇，右頸總動(dòng)脈插管至左心室，連接血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定儀(Power Lab，Australia)。

2 存活率觀察

復(fù)蘇完成后，結(jié)扎股動(dòng)靜脈，縫合傷口，按照10萬(wàn)U/kg體重的劑量肌肉注射青霉素和鏈霉素，給予正常飲水和食物，觀察1d內(nèi)大鼠存活情況，計(jì)算24h內(nèi)的存活率和存活時(shí)間(存活時(shí)間＞24h的按照24h計(jì)算)。

3 血管反應(yīng)性和鈣敏感性測(cè)定

復(fù)蘇完成2h后，活殺大鼠取腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)一級(jí)分支，制成約2.5 mm長(zhǎng)的微血管環(huán)，將其固定在微血管肌動(dòng)描記儀上，浸入Krebs-Henseleit(K-H)液中平衡微血管環(huán)，直至張力曲線趨于水平。累積濃度法檢測(cè)微血管環(huán)對(duì)梯度濃度去甲腎上腺素(NE)的收縮反應(yīng)性;將K-H液換成髙鉀液，累積濃度法檢測(cè)微血管環(huán)對(duì)梯度濃度Ca2+的收縮反應(yīng)性。作量-效曲線，曲線擬合法求最大收縮力(Emax)，用NE和Ca2+的量-效曲線、Emax評(píng)價(jià)血管反應(yīng)性和鈣敏感性［5］。

4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)觀察

在休克前、休克末、復(fù)蘇0h、復(fù)蘇1h、復(fù)蘇2h時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)右頸總動(dòng)脈連接血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定儀測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括左室收縮壓(left intraventricular systolic pressure，LVSP)，左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，左室壓最大上升/下降速率(maximal change rate of left intraventricular pressure，±dp/dtmax)，心 率(heart rate，HR)［6］。通過(guò)靜脈插管推注NE(3μg/kg)，記錄給NE前后大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)值，其差值即為NE作用后MAP變化，即NE升壓效應(yīng)［7］。

5 肝、腎血流量檢測(cè)

在休克前、休克末、復(fù)蘇0h、復(fù)蘇2h時(shí)間點(diǎn)，用激光多譜勒組織血流量測(cè)定儀(Periflux system 5000;Perimed，Stockholm，Sweden)的激光探針刺入肝、腎組織下約0.5cm，測(cè)定器官血流量。

6 肝、腎線粒體功能檢測(cè)

呼吸控制率(respiration control ratio，RCR)測(cè)定:在休克前、休克末、復(fù)蘇0h、復(fù)蘇2h時(shí)間點(diǎn)，提取肝和腎線粒體，采用溶氧儀(MT 200;Strathkelvin，North Lanarkshire，Scotland)測(cè)定有二磷酸腺苷(ADP)刺激(3態(tài)呼吸)和無(wú)ADP刺激(4態(tài)呼吸)下的氧氣消耗量(nmol/min/mg蛋白)，呼吸控制率=呼吸3態(tài)/呼吸4態(tài)［6］。

Na+-K+-三磷酸腺苷(ATP)酶活性(μmol/g)測(cè)定:采用Na+-K+-ATP酶ELISA試劑盒(R＆D Systems，Minneapolis，MN)測(cè)定。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠存活時(shí)間變化

正常對(duì)照組的所有大鼠存活均＞24h，休克組的所有大鼠均未能存活到24h，平均存活時(shí)間為1.75h;LR復(fù)蘇組有5只大鼠存活＞24h，平均存活時(shí)間為14.90h;缺血預(yù)適應(yīng)組延長(zhǎng)大鼠的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)顯著，可達(dá)20.50h(P＜0.01)，8只大鼠存活＞24h(圖1)。

圖1 缺血預(yù)適應(yīng)延長(zhǎng)失血性休克復(fù)蘇大鼠存活時(shí)間(n=10)

2 血管反應(yīng)性和鈣敏感性變化

失血性休克后血管反應(yīng)性和鈣敏感性顯著降低，NE和Ca2+的Emax降低至正常對(duì)照組的40.84%和54.57%，LR復(fù)蘇組血管反應(yīng)性和鈣敏感性部分恢復(fù)，NE和Ca2+的Emax增高至正常對(duì)照組的59.45%和63.20%(P＜0.01);缺血預(yù)適應(yīng)組血管反應(yīng)性和鈣敏感性顯著增高，使NE和Ca2+的Emax增高至正常對(duì)照組的85.07%和80.90%(P＜0.01)(圖2)。

圖2 缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性(a)和鈣敏感性(b)的保護(hù)作用(n=10)

3 血流動(dòng)力學(xué)的變化

失血性休克后，大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)MAP、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax和HR顯著降低至正常對(duì)照組的31.61%、45.18%、37.41%、38.05%、28.83%和62.27%(P＜0.01)，LR復(fù)蘇組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)部分恢復(fù)，上升至正常對(duì)照組的50.73%、67.10%、45.10%、49.41%、37.76%和76.39%(P＜0.01)，缺血預(yù)適應(yīng)組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)顯著恢復(fù)，接近正常水平(至正常對(duì)照組的74.59%、82.34%、76.04%、83.38%、78.94%和83.06%，P＜0.01)。失血性休克后，NE的升壓效應(yīng)顯著降低，血壓由正常的29.36mmHg降低至11.70mmHg(P＜0.01)，LR復(fù)蘇組可部分恢復(fù)NE的升壓效應(yīng)至20.89mmHg，缺血預(yù)適應(yīng)組可進(jìn)一步恢復(fù)NE的升壓效應(yīng)至接近正常水平(28.85mmHg，P＜0.01，表1)。

4 肝、腎血流量的變化

失血性休克后肝、腎的血流量顯著降低至正常對(duì)照組的44.17%和37.46%;LR復(fù)蘇組血流量有顯著回升，至正常對(duì)照組的75.70%和70.93%(P＜0.01);缺血預(yù)適應(yīng)組血流量進(jìn)一步回升，至正常對(duì)照的96.63%和95.73%(P＜0.01，表2)。

5 肝、腎線粒體功能的變化

失血性休克后，肝和腎的線粒體功能顯著降低，表現(xiàn)為RCR和Na+-K+-ATP酶活性的降低，LR復(fù)蘇組其功能顯著恢復(fù)，缺血預(yù)適應(yīng)組肝和腎的RCR分別較LR復(fù)蘇組增高30.72%和28.66%(P＜0.01)，Na+-K+-ATP酶活性分別較LR組增高65.11%和72.18%(P＜0.01，表2)。

表1 缺血預(yù)適應(yīng)改善失血性休克大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(n=10)

表2 缺血預(yù)適應(yīng)增加失血性休克大鼠肝和腎血流量，改善線粒體功能(n=10)

討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克后的血管低反應(yīng)性是導(dǎo)致休克晚期微循環(huán)功能障礙、組織細(xì)胞缺血缺氧的重要原因［1－3］，然而目前卻沒(méi)有很好的方法可以有效地糾正血管低反應(yīng)性。缺血預(yù)適應(yīng)是目前常用的誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)的方法，可在心臟、腦、肝、視網(wǎng)膜等多種器官誘導(dǎo)對(duì)抗缺血缺氧的保護(hù)作用［8－9］，并能通過(guò)增高血管鈣敏感性誘導(dǎo)對(duì)失血性休克血管反應(yīng)性的保護(hù)效應(yīng)［4］。但缺血預(yù)適應(yīng)能否誘導(dǎo)對(duì)失血性休克的保護(hù)效應(yīng)，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)適應(yīng)可顯著延長(zhǎng)失血性休克復(fù)蘇大鼠存活時(shí)間，恢復(fù)血管對(duì)NE和Ca2+的收縮反應(yīng)性，改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)MAP、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax、HR和NE升壓效應(yīng)，增加肝和腎的血流量、線粒體RCR和Na+-K+-ATP酶活性，提示缺血預(yù)適應(yīng)通過(guò)恢復(fù)血管反應(yīng)性和鈣敏感性，改善血流動(dòng)力學(xué)，維持重要器官血流灌注和線粒體功能，從而延長(zhǎng)失血性休克復(fù)蘇大鼠的存活時(shí)間，起到對(duì)失血性休克的保護(hù)作用。

盡管在臨床已存在缺血和休克的患者中，預(yù)適應(yīng)保護(hù)的應(yīng)用尚有很大局限，然而對(duì)于那些即將出現(xiàn)大量失血如接受大型手術(shù)的患者，仍有重要的保護(hù)意義。例如，在冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)中，雖然術(shù)中采取了多種保護(hù)措施，但仍經(jīng)常出現(xiàn)術(shù)后左室功能損傷，在急性冠狀動(dòng)脈綜合征的高風(fēng)險(xiǎn)人群，死亡率可高達(dá)3.7%，術(shù)中梗死率約10%［10］。缺血預(yù)適應(yīng)可發(fā)揮很好的保護(hù)作用，如86名冠脈搭橋手術(shù)患者，缺血預(yù)適應(yīng)可降低術(shù)中，以及術(shù)后24h室性心律不齊的發(fā)生率［11］。本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)為將缺血預(yù)適應(yīng)用于改善血流動(dòng)力學(xué)，維持重要器官血流灌注和線粒體功能，增強(qiáng)失血性休克復(fù)蘇效果提供了理論基礎(chǔ)。然而，此實(shí)驗(yàn)局限在嚙齒類動(dòng)物，缺血預(yù)適應(yīng)能否在其它種屬的動(dòng)物甚至靈長(zhǎng)類動(dòng)物誘導(dǎo)對(duì)失血性休克的保護(hù)，仍需要進(jìn)一步研究。

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