桿狀病毒表達載體在醫學領域中的應用進展

單士剛，包永芬，陳賢均

(咸寧學院基礎醫學院，湖北咸寧437100)

體外基因表達系統包括原核細胞系統和真核細胞系統。原核細胞系統主要是大腸桿菌細胞系。真核細胞系統包括哺乳動物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞等表達系統。其中昆蟲細胞表達系統，即桿狀病毒表達系統(BEVS)，因其獨特的生物學特性，在過去的20年里，已作為一種真核表達載體被廣泛應用。本研究就該系統的主要特性、種類以及在醫學領域中的應用等方面進行闡述。

1 桿狀病毒及其表達系統

桿狀病毒是一類專門寄生于節肢動物的病原微生物。目前全世界已發現600多種桿狀病毒，其中研究最深入的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)。AcNPV病毒粒子成桿狀，病毒囊膜直接包被著約130 kb的雙鏈、環狀DNA分子，其全基因組序列已經測定清楚。20世紀80年代后期昆蟲桿狀病毒已被成功開發作為一種基因表達的載體，即昆蟲桿狀病毒基因表達系統。目前其被廣泛應用于外源目的基因的表達。由于利用真核的昆蟲幼蟲或昆蟲細胞作為宿主，其表達的蛋白質能夠進行正確的轉錄后加工;桿狀病毒基因組本身較大且可操作性好，可以容納多個基因或較大的基因，而且桿狀病毒在自然條件下不能感染脊椎動物，生物安全性好，這些優點使桿狀病毒基因表達系統成為一項比較成熟、安全、經濟、高效的蛋白質表達技術［1］。經歷幾十年的發展，圍繞擴大桿狀病毒表達體系的應用范圍，科學家們對此體系進行了一系列的改造。截止到目前，已有19種商品化的桿狀病毒表達體系得到廣泛應用［2］。

2 桿狀病毒表達體系在醫學中的應用

2.1 作為基因治療載體 到目前為止人類已經發現27種非人類病毒載體可用于臨床疾病的治療［3］，其中桿狀病毒是非復制型載體，且重組桿狀病毒載體具有容量大、易操作、易純化和安全性高的特點，因而是一種很有應用前景的基因轉移載體［4］。自首次報道運用桿狀病毒介導的p53基因治療骨肉瘤以來，已有許多利用桿狀病毒基因轉移技術進行心血管、前列腺、腫瘤、神經系統等疾病的治療研究。新近發現桿狀病毒還是潛在的、長期的、高效的體內轉移基因載體。Pieroni等將桿狀病毒注射到不同鼠種的后四頭肌中時，報告基因得到了表達，一些鼠種的報告基因甚至表達了35～178 d。這使桿狀病毒在基因治療方面更具有應用潛力。最近，有研究肯定了用含有白喉毒素基因的桿狀病毒對于神經膠質瘤治療的效果［5］;通過桿狀病毒介導在人胚胎干細胞內也獲得了瞬間和穩定的基因表達［6］，并且研究表明桿狀病毒能夠作為用于干細胞和骨組織工程中的新型基因轉移載體［7，8］。為了更好地發揮桿狀病毒在哺乳細胞中的作用，有學者對桿狀病毒載體進行了改良。用含有巨細胞病毒(CMV)啟動子和綠色熒光報告基因(gfp)的病毒進行有效的桿狀病毒介導性轉導，已在一系列細胞系和原代培養物中證實;另一種能有效并穩定地將重組基因導入細胞的桿狀病毒載體也已報道。這種病毒含有1對表達盒(B-gal和潮霉素抗性)，并以來自腺病毒伴隨病毒(AAV)的倒置末端重復序列(ITR)為側翼［9］。

總之，重組桿狀病毒作為基因轉移載體應用于哺乳動物細胞已經得到廣泛證實。桿狀病毒通過一種尚未闡明的侵入機制，使其成為一個能對許多哺乳動物細胞系進行高效轉移的載體。但許多問題，特別是體內轉導及其機制等需要進一步研究和解決。

2.2 作為基因表達載體用于疫苗研制 桿狀病毒表達系統由于其不具有任何對哺乳動物有潛在致病性的動物病毒片段，得到了人們的高度重視，被越來越多的應用于多肽藥物和疫苗研制方面［10］。目前，桿狀病毒表達載體已用于多種疫苗的生產研制，主要集中于病毒和寄生蟲疫苗，如HIV疫苗已于20世紀80年代進入臨床，瘧疾疫苗已于20世紀90年代進入臨床。與這兩種疫苗相比，針對細菌感染的基因工程疫苗則研究報道較少。相信隨著時間的推移，BVES系統用途會得到更大擴展。

2.3 作為生物納米材料 近幾年來的研究致力于將生物學的工具用于納米科技領域，即將生物學應用于納米科技，從而產生了生物納米技術。生物學材料可能是仿生納米級物體的獨特工具，有序的納米級生物分子是仿生無機納米結構很好的模板。利用生物病毒開發納米生物技術是近年引人注目、迅速發展的一個領域。桿狀病毒自身具有納米級結構，因此成為生物納米技術領域中非常誘人的建筑材料。目前雖然有關利用昆蟲桿狀病毒應用于納米領域的報道還不多，但已出現一些新的研究動向，如應用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞內生產SV40核衣殼蛋白，使之進行自我組裝，成為一個能夠輸送生物活性物質的納米膠囊［11］，有望應用于基因治療領域。利用桿狀病毒產生類似于犬細小病毒新的納米材料，應用于腫瘤的治療［12］。

2.4 用于表達免疫活性分子和重組藥物蛋白 桿狀病毒表達載體自問世以來，由于其不具任何對哺乳動物有潛在的致病性的動物病毒片段，表達的產物成本低、表達量高、構象接近天然蛋白等特點，因此可用于免疫活性分子和重組藥物蛋白(如抗原、抗體、生長因子、酶、干擾素等)的大量生產。自1983年首次表達IFN-β以來，已經表達了(如生長因子、酶、干擾素等)大量活性免疫分子和重組藥用蛋白，且具有廣泛的應用和市場前景。近來，Machado等［13］成功表達了漢坦病毒核蛋白，可用于血清學檢測。

2.5 用于基于細胞的藥物篩選 長期以來對乙肝病毒的研究由于缺乏一種合適的體外培養系統而受到限制，為此Delaney等［14］發展了一種新的體外表達系統。他們將具有復制性的HBV基因組重組至AcMNPV，用此重組AcMNPV介導HBV基因組進入HepG2細胞系并使其得到高水平復制和表達，由此構建HBV-AcMNPV-HepG2表達系統。并運用此系統評價了抗病毒藥物拉米夫定對HBV復制及共價閉合環狀DNA聚集的影響。隨后Delaney等［15］又將HBV耐藥株重組至AcMNPV，并用此重組病毒測試了HBV耐藥株對不同藥物的交叉耐藥性。Adelhamed等［16］報道采用HBV-桿狀病毒系統對拉米夫定和Clevudine的抗HBV效果進行了比較。

總之，桿狀病毒表達載體具有基因容量大、操作性好、表達效率高、生物安全性好、靶向性強等優點，在醫學領域的研究中應用越來越廣泛，對醫學研究具有重要指導意義。隨著生物技術的不斷進步，BEVS的研究必將更加深入、完善。

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