飼用β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展

謝志恒，崔細(xì)鵬，周平發(fā)，史寶軍

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含有β-1,4-甘露糖苷鍵的甘露聚糖及其衍生物（半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖）的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類，能消除甘露聚糖對(duì)單胃動(dòng)物各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，其分解產(chǎn)物甘露寡糖在動(dòng)物腸道中也起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。隨著對(duì)自然界半纖維素資源的開(kāi)發(fā)、飼料β-甘露聚糖抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除以及甘露低聚糖藥用價(jià)值，β-甘露聚糖酶的研究和利用已進(jìn)入一個(gè)新階段。

1 β-甘露聚糖酶的來(lái)源及理化性質(zhì)

1.1 來(lái)源

β-甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中，在一些低等動(dòng)物如海洋軟體動(dòng)物翡翠貽貝、蝸牛、淡菜等腸道分泌液中，植物芝麻、番茄、胡蘿卜等種子，豆類植物四棱豆、長(zhǎng)角豆、瓜兒豆等發(fā)芽種子以及天南星科植物魔芋粉萌發(fā)的球莖中，微生物細(xì)菌中的芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌等，真菌中的曲霉、木霉、青霉等，放線菌中鏈霉菌等都發(fā)現(xiàn)β-甘露聚糖酶活性的存在[2-3]。微生物是飼用β-甘露聚糖酶的主要來(lái)源，微生物來(lái)源的β-甘露聚糖酶具有很多優(yōu)點(diǎn)，例如酶活性高、生產(chǎn)成本低、提取方便、pH和溫度作用范圍廣以及底物專一性較高，因此已經(jīng)在工業(yè)化生產(chǎn)和理論研究中得到廣泛的應(yīng)用。

趙娜等從蝸牛肝臟組織中分離出β-甘露聚糖酶[4]。赫崇慧研究發(fā)現(xiàn)番茄中存在甘露聚糖酶，并與多聚半乳糖苷酶、果膠酯酶和纖維素酶之間存在協(xié)同關(guān)系，影響著果實(shí)的軟化[5]。張清霞等從土壤分離到1株β-甘露聚糖酶產(chǎn)量高的菌株Bacillus sp.N-6，通過(guò)比較16S rDNA序列相似性及生理生化性狀鑒定為枯草芽孢桿菌[6]。吳襟等報(bào)道了諾卡氏菌形放線菌Nocardioform actinomucetes NA3-540可產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶[7]。程池等以稻草和麩皮為基質(zhì)通過(guò)里氏木霉Rut C-30進(jìn)行固體發(fā)酵，對(duì)其產(chǎn)生的非淀粉多糖酶（NSP酶）進(jìn)行分析，結(jié)果表明，里氏木霉Rut C-30產(chǎn)生的NSP酶系較全，其中包括β-甘露聚糖酶[8]。隨著研究不斷深入，越來(lái)越多的動(dòng)物、植物和微生物被陸續(xù)地發(fā)現(xiàn)存在甘露聚糖酶活性。

大量研究表明，微生物生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的機(jī)制雖然不盡相同，但大多數(shù)以胞外誘導(dǎo)酶的形式存在于生物體，只有很少的以結(jié)構(gòu)酶形式存在，對(duì)于大部分產(chǎn)β-甘露聚糖酶的微生物，在培養(yǎng)基中添加少量的甘露聚糖（例如甘露聚糖、魔芋粉、槐豆膠或其水解物），能極大提高產(chǎn)酶水平。Lin等以脫脂椰子肉（含甘露聚糖）作為碳源進(jìn)行Aspergillus niger NCH-189發(fā)酵，產(chǎn)酶能力提高400%[9]。隨著微生物生產(chǎn)研究的不斷深入，高產(chǎn)菌株的發(fā)現(xiàn)和發(fā)酵條件的優(yōu)化，β-甘露聚糖酶的微生物產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)進(jìn)程進(jìn)一步加速。鄔敏辰等以黑曲霉LW2129菌株三角瓶固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)為基礎(chǔ)，經(jīng)曲盤固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)一步放大到30 m3固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模，酶活性可達(dá)干曲26 725～29 218 U·g-1[10]。

1.2 理化性質(zhì)

不同微生物所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量、pH和溫度作用范圍、等電點(diǎn)、酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)、底物專一性等都有一定差異。細(xì)菌中研究最多的是芽孢桿菌，其產(chǎn)生β-甘露聚糖酶等電點(diǎn)為4.0～5.0，最適pH除嗜堿芽孢桿菌為9.0～10.0外，其余多為5.5～7.0，最適反應(yīng)溫度為50～70℃，一般都有較強(qiáng)的耐熱性；真菌來(lái)源的β-甘露聚糖酶等電點(diǎn)為4.0～5.0，最適pH為4.5～5.5，最適反應(yīng)溫度為55～75℃，相對(duì)細(xì)菌而言，其pH的穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH都偏低，耐熱性也比芽孢桿菌弱；植物細(xì)胞產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度和耐熱性比細(xì)菌和真菌低，最適反應(yīng)pH為4.5～5.5[11-12]。

周芳從土壤中篩選出一株較高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的芽孢桿菌屬菌種，并對(duì)其產(chǎn)的β-甘露聚糖酶進(jìn)行分離純化，此酶最適反應(yīng)的pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為50℃，＜50℃酶活力穩(wěn)定。酶對(duì)魔芋膠、刺槐豆膠和瓜兒豆膠的Km值分別為3.97、8.79和17.56 mg·mL-1，Vmax值分別為 9.02、12.44和 20.92 μmol·min-1·mL-1[13]。朱劼等將純化的黑曲霉Asper?gillus niger WM20-11所產(chǎn)的酸性β-甘露聚糖酶經(jīng)IEF-PAGE測(cè)得酶的等電點(diǎn)為4.0，最適pH和溫度分別為3.5和70℃，酶對(duì)角豆膠的Km和Vmax分別為 66.7 g·L-1和 333 μmol·min-1·mL-1[14]。

2 β-甘露聚糖酶的分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)和作用方式

2.1 分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)

近年來(lái)，隨著β-甘露聚糖酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，對(duì)β-甘露聚糖酶研究也不斷深入，其結(jié)構(gòu)研究也取得了突破性進(jìn)展。目前，對(duì)β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)研究主要集中在微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶方面，已經(jīng)有十幾種微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)被解析。研究表明，大部分β-甘露聚糖酶具有催化域和非催化域兩部分，催化域折疊成TIM桶狀結(jié)構(gòu)，參與底物的結(jié)合與催化；非催化域是碳水化合物結(jié)合域，采用經(jīng)典的三明治結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)結(jié)合有纖維素的甘露糖水解能力，但是有一些復(fù)雜的β-甘露聚糖酶不止具有1個(gè)催化域。根據(jù)β-甘露聚糖酶催化域的特點(diǎn)，所有已知的β-甘露聚糖酶被分為2個(gè)糖苷水解酶家族，即家族5和家族26[15-16]。

細(xì)菌中研究最多的是芽孢桿菌產(chǎn)的β-甘露聚糖酶，Ma等從枯草芽孢桿菌N16-5中分離純化出一種堿性β-甘露聚糖酶，該酶的基因（manA）包括一個(gè)長(zhǎng)1 479 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），與糖苷水解酶家族5的基因具有高度同源性[17]。近年來(lái)真菌來(lái)源的β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)研究也備受關(guān)注，Hag?glund等從里氏木霉產(chǎn)物中分離出的β-甘露聚糖酶基因（Man5A）包括一個(gè)N端的催化元件和一個(gè)C端碳水化合物結(jié)合元件（CBM），Man5A屬于糖苷水解酶家族5，CBM起到結(jié)合纖維素的作用，促進(jìn)纖維素的降解[18]。

2.2 作用方式

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含有甘露糖的多糖水解酶的總稱，一般可分為外切β-甘露聚糖酶和內(nèi)切β-甘露聚糖酶。對(duì)于甘露聚糖類物質(zhì)的降解主要依靠?jī)?nèi)切β-甘露聚糖酶，其對(duì)底物有嚴(yán)格的鍵專一性，即β-甘露聚糖酶能夠降解甘露聚糖酶、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露糖苷鍵，而對(duì)其他的化學(xué)鍵不起作用。研究證明，β-甘露聚糖酶作用于魔芋膠或槐豆膠的作用位點(diǎn)是多糖鏈上非還原端的第3或第4個(gè)糖分子，水解產(chǎn)物為M-G，G-M，G-G，M-M，M-M-M，G-G-M，M-G-M，G-M-M， M-M-M-M， G-M-M-M， G-M-M-G，G-G-M-M，M-M-M-M-M。雖然不同來(lái)源的β-甘露聚糖酶對(duì)不同底物的作用方式和作用產(chǎn)物不同，但是產(chǎn)物主要是低聚糖，很少或根本不產(chǎn)生單糖。同時(shí)在分解甘露聚糖過(guò)程中，由于甘露聚糖的結(jié)構(gòu)使得多種主鏈酶、側(cè)鏈酶在降解甘露聚糖時(shí)會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用[19]。在Sclerotium rolfsi中兩種β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的協(xié)同作用使得降解半乳甘露聚糖產(chǎn)生的單體數(shù)量增多，水解產(chǎn)物的總量增加。T.neapolitana 5 068中的耐熱型β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶和α-半乳糖苷酶也可協(xié)同水解半乳甘露糖為單糖[20]。

3 在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料消化率

β-甘露聚糖是飼料原料細(xì)胞壁的主要組成部分，其能結(jié)合大量水分，使消化道內(nèi)容物黏度升高，減少破壁后養(yǎng)分與消化酶的接觸，阻礙已消化養(yǎng)分的擴(kuò)散和吸收；其也能把淀粉、蛋白質(zhì)、脂類和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，阻礙機(jī)體消化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。β-甘露聚糖酶能夠把β-甘露聚糖降解為低聚糖，減少了β-甘露聚糖與水分子的相互作用，從而促進(jìn)細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時(shí)能把細(xì)胞里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化率。應(yīng)琳琳等研究β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬消化率的影響，結(jié)果表明，在飼料中添加β-甘露聚糖酶可以降低腹瀉率，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，可以不同程度地提高日糧營(yíng)養(yǎng)成分的消化率[21]。付錦鋒等研究甘露聚糖酶對(duì)豬生長(zhǎng)性能和消化率的影響，結(jié)果表明，在含有DDGS 10%和15%的基礎(chǔ)日糧中添加甘露聚糖酶400 U·kg-1，可以提高傳統(tǒng)生長(zhǎng)和育肥豬生長(zhǎng)性能和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率（P＜0.05）[22]。

3.2 提高飼料能量利用率

在常規(guī)飼料原料中，豆粕中β-甘露聚糖含量最高，為1.3%～1.6%，而豆粕的能量利用率僅為50%～60%，這與豆粕中存在的β-甘露聚糖有很大的關(guān)系。馬成杰等研究表明，在櫻桃谷商品肉鴨基礎(chǔ)日糧中添加和美酵素（β-甘露聚糖酶）100 mL，可以提高飼料的能量利用率；降低飼糧代謝能商品肉鴨的生產(chǎn)性能不受影響，其遺傳性能夠發(fā)揮正常，同時(shí)可降低飼料成本22.19元·t-1[23]。張輝華等研究β-甘露聚糖酶對(duì)肉鴨椰籽粕消化率的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，A組（基礎(chǔ)飼料70%+椰籽粕30%+β-甘露聚糖酶）蛋白質(zhì)消化率與真實(shí)消化率比B組（基礎(chǔ)飼料70%+椰籽粕30%）分別高8.04%與7.35%，差異均顯著（P＜0.05）；A組能量利用率與真實(shí)利用率比B組分別高3.61%與3.38%，差異均顯著（P＜0.05）[24]。

3.3 改善腸道微生物環(huán)境，提高動(dòng)物免疫功能

動(dòng)物胃腸道中存在有益菌和有害菌，當(dāng)有害菌占優(yōu)勢(shì)時(shí)，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)各種疾病。β-甘露聚糖酶降解β-甘露聚糖的產(chǎn)物甘露寡糖（MOS）能夠選擇性促進(jìn)動(dòng)物胃腸道有益菌大量增殖，使其在胃腸道中形成優(yōu)勢(shì)菌群，從而抑制外源菌和胃腸道內(nèi)固有腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖；MOS還能夠結(jié)合細(xì)菌表面外源凝集素，從而減少細(xì)菌與腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合的機(jī)會(huì)，最終使病原菌排除體外，減輕病原菌對(duì)機(jī)體的毒害作用，保護(hù)腸黏膜的完整性，改善胃腸道微生物環(huán)境。MOS能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌含有甘露糖基的糖蛋白，這些糖蛋白可以結(jié)合侵入機(jī)體的細(xì)菌，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的多級(jí)免疫反應(yīng)，提高動(dòng)物免疫功能。李路勝等選用公母混合的1日齡肉雛雞考察甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道微生物和免疫機(jī)能的影響，結(jié)果表明，與低能日糧組相比，試驗(yàn)組（低能日糧+甘露聚糖酶500 g·t-1）肉雞的胸腺指數(shù)和新城疫抗體分別提高了29.70%和7.44%，差異顯著（P＜0.05）；在腸道微生物菌群和pH方面，添加甘露聚糖酶與對(duì)照組相比均有改善[25]。喬海云等研究甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道微生物和免疫指標(biāo)的影響，測(cè)定各組肉仔雞的免疫器官指數(shù)、腸道大腸桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)、腸道內(nèi)容物pH，結(jié)果表明，在玉米豆粕型日糧中添加β-甘露聚糖酶可以提高肉雞的免疫性能，降低腸道酸堿度，抑制大腸桿菌，增加乳酸菌等有益菌的數(shù)量（P＜0.05）[26]。

3.4 促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，提高生長(zhǎng)速度

有研究報(bào)道，β-甘露聚糖酶能夠顯著提高動(dòng)物胰島素生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ）水平，改善單胃動(dòng)物的生長(zhǎng)性能（P＜0.05）。IGF-Ⅰ是畜禽的生長(zhǎng)調(diào)控因子，生長(zhǎng)激素（GH）的促進(jìn)作用也是IGF-Ⅰ介導(dǎo)的。IGF-Ⅰ作用于生長(zhǎng)組織，刺激細(xì)胞為氨基酸的利用從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，抑制蛋白質(zhì)的分解，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的凈增長(zhǎng)。韓國(guó)清研究β-甘露聚糖酶對(duì)仔豬血清中IGF-Ⅰ的影響，結(jié)果表明，添加β-甘露聚糖酶的試驗(yàn)組B、C和D分別比空白對(duì)照組A提高了3.22%、2.05%、3.17%，差異不顯著（P＞0.05），但試驗(yàn)組有增加IGF-Ⅰ含量的趨勢(shì)[27]。李海英等試驗(yàn)結(jié)果表明，β-甘露聚糖酶可提高肉仔雞體重4.7%，提高胸肌率8.1%，差異顯著（P＜0.05）[28]。

4 小結(jié)

在飼糧中添加β-甘露聚糖酶能夠降解β-甘露聚糖，降低消化道內(nèi)容物的黏度，釋放細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分，提高飼料轉(zhuǎn)化率和能量利用率，其產(chǎn)物甘露寡糖能夠改善腸道微生物菌群和保護(hù)腸黏膜的完整性，減少有害菌的生長(zhǎng)繁殖，提高動(dòng)物的免疫功能，同時(shí)β-甘露聚糖酶具有無(wú)毒害、無(wú)殘留、可降解等優(yōu)點(diǎn)，而且可以降低畜禽糞便中有機(jī)物、氮和磷的排放量，緩解發(fā)展畜牧業(yè)與保護(hù)環(huán)境之間的矛盾，因此開(kāi)發(fā)前景十分廣闊。

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