EML4-ALK融合基因在非小細胞肺癌中的研究進展

華紅偉綜述 丁 罡審校

棘皮動物微管結合樣蛋白4(echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4)與間變淋巴瘤激酶(anaplastie lymphoma kinase，ALK)融合基因EML4-ALK是非小細胞肺癌中繼EGFR突變，K-ras突變后又一特異性分子標記物，近些年來引起了高度重視，有望成為NSCLC新的靶點。本文就EML4-ALK融合基因的發現和檢測，生物學特性，EML4-ALK抑制劑的應用等綜述如下。

1 EML4-ALK的發現及生物學特征

1.1 EML4-ALK的發現及亞型

EML4-ALK是NSCLC中最新發現的1種癌基因。EML4是棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白質家族成員［1］，它包括一個N-端基本區，一個疏水的棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白域和WD重復區。ALK首先在間變性大細胞淋巴瘤中被發現，作為一個核磷蛋白的融合者，伴隨一個t(2;5)染色體重排［2］。EML4-ALK融合基因最初是在2007年由Soda等［3］首先發現的，他們從1例62歲吸煙的肺腺癌患者的腫瘤組織中擴增出由3，926 bp組成的DNA片段，該片段可以編碼一個由1 059個氨基酸組成的蛋白質。該蛋白質的N末端是由人類EML4基因編碼蛋白的一部分，而羧基端是人類ALK基因編碼的胞內絡氨酸激酶信號受體。EML4一ALK融合基因由第2號染色體短臂插入引起(包括2p21和2p23)，由ALK基因的3'端與EML4基因的5'倒位融合形成。以EML4的這部分區域代替ALK的包外區和跨膜控制區將導致ALK激活酶控制區特定的二聚化作用，以及由此產生的持續的接觸反應活動，從而導致細胞的異常增殖，導致癌變。在隨后的研究中，他們應用RT-PCR的方法在75例肺癌患者中提取腫瘤癌組織檢測該融合基因，發現共有5例(6.7%)患者(3例腺癌，2例鱗癌)EML4-ALK融合基因表現為陽性，同時發現該基因陽性的患者與EGFR和K-ras突變陽性的患者沒有重疊，并且檢測了261例其他惡性腫瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、結直腸癌、胃腸道腫瘤)均未發現該融合基因。因此，該融合基因很有可能是非小細胞肺癌的一個新的特異性基因靶點。

研究發現，該染色體倒置并不總是發生在相同的部位，目前已發現多個EML4-ALK變異亞群。包括亞型3(E6;A20)［4］、亞型 4(E15;A20)，亞型 5(E2;A20)［5］，亞型 6(E18;A20)，亞型7(E14;A20)［6］等，其中，最常見的變異位點為 E13;A20(存在于NSCLC細胞株H3122和DFCI032中)及E6a/b;A20(存在于NSCLC細胞株H2228)，分別被成為變異1和變異3a/b，在非小細胞肺癌中分別占33%和29%［7］。所有的亞型都含有ALK胞內酪氨酸激酶結構域，始于編碼外顯子20的位置。這些亞群是否具有不同的臨床意義還有待進一步研究。

1.2 EML4-ALK融合基因在NSCLC中的發生率及臨床生物學特征

研究表明，EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中陽性比例較低。Solomon等［8］發現不加選擇的NSCLC患者EML4-ALK融合基因總發生率為0.4% ～13.5%，這部分患者多為非吸煙者，且大多數是肺腺癌。2009年Wong等［9］對266例手術切除的原發性肺癌患者的標本進行了檢測，在13例NSCLC患者(4.9%)標本中檢出了融合基因，并發現融合基因更易發生于不吸煙、年輕以及EGFR，K-ras野生型的肺癌患者。Shaw等［10］為提高融合基因的陽性率，他們以女性、亞裔、輕度或者不吸煙的腺癌中至少符合2項為標準，挑選了141例NSCLC，使用熒光原位雜交技術(fluorescent in situ hybridization，FISH技術)檢測 EML4-ALK、EGFR以及K-ras突變情況。結果表明，13%(19例)患者為EML4-ALK陽性，上述3種突變沒有重疊。與EGFR突變(31例)和EGFR、ALK突變均陰性的野生型(91例)相比，EML4-ALK陽性的患者更年輕(P ＜0.001)，多為男性(P=0.036)，輕度或者不吸煙(P＜0.001)，這些臨床特征有助于EML4-ALK的識別和肺癌的早期診斷。為了更好地了解中國人群中該融合基因的表達情況，Zhang等［11］在103例非小細胞肺癌中將RACE偶聯PCR測序技術(RACE-coupled PCR sequencing)檢測ALK融合基因的頻率，發現中國的非選擇性NSCLC患者中該融合基因的發生率為11.6%，但肺腺癌患者可升至19.2%，從不吸煙者為19.2%，EGFR和K-ras均為野生型的肺腺癌患者則高達42.8%。該研究表明，EML4-ALK融合基因與以下3個因素有關:無吸煙史(P=0.03)，年紀較輕初發者(P=0.03)，無 EGFR/KRAS突變的肺腺癌(P=0.04)。并且，EML4-ALK融合基因陽性的肺癌中ALK的mRNA水平要高于該融合基因陰性的患者，但是EML4的表達在EML4-ALK融合基因陰性組與陽性組中無差別，因此EML4-ALK融合基因可能與ALK的的表達水平有著密切的關系。2010年，Sun等［12］對東亞地區非吸煙肺腺癌中的突變基因進行研究。分析從單一群體中(復旦大學附屬上海腫瘤醫院，中國上海)切除的52例無吸煙史的肺腺癌并發的基因突變:KRAS，NRAS，HRAS，HER2，BRAF，ALK，PIK3CA，TP53和LKB1。結果發現41例腫瘤存在EGFR突變，3例存在EML4-ALK融合基因，2例存在FER2插入，1例存在KRAS突變。BRAF，NRAS，HRAS，LKB1突變未被發現。此項研究是首個對一大群東亞地區無吸煙史的肺腺癌患者全面且同步地分析主要致瘤突變的研究，進行突變預測試驗對于個體化的靶向治療有重要的指導意義。

既往的研究［3，11］認為 EGFR突變與 EML4-ALK突變不共存，EML4-ALK融合型基因可能是繼KRAS之后的EGFR對TKI耐藥的另外一個原因。隨著研究的深入，臨床發現了EGFR突變與EML4-ALK突變同時存在的病例，如Tiseo等［13］報道了1例同時具有EGFR突變和EML4-ALK突變的病例，該患者是1例48歲無吸煙史的高加索男性患者，使用EGFR-TKIs(厄洛替尼)治療未有臨床益處。而Kuo等［14］報道了1例72歲的非吸煙女性肺腺癌患者，該患者同時具有EGFR突變和EML4-ALK突變但使用EGFR-TKIs(吉非替尼)卻有臨床效果。因此，當患者存在EML4-ALK融合基因時，還應仔細檢測是否存在EGFR突變，對同時存在EGFR突變和EML4-ALK突變的肺癌的臨床生物學特征和最佳治療方案還有待進一步研究。

2 EML4-ALK的檢測方法

在臨床實踐中已使用多種技術來檢測EML4-ALK融合基因，包括PCR技術(polymerase chain reaction)，免疫組化技術(immunohistochemistry，IHC)，熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridsation，FISH)等。但是，目前還沒有標準方法來檢測非小細胞肺癌中的EML4-ALK融合基因。

2.1 逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)

RT-PCR可能是檢測NSCLC中ALK融合基因的有效手段，該技術靈敏度較高，檢測到基因擴增產物則暗示著ALK的重排。但是，RT-PCR分析基于單管多重技術(muitiplex)，不能檢測EML4-ALK融合基因的未知亞型，其對引物的要求較高，并且檢測甲醛固定的石蠟包埋切片，RNA易大量降解而降低其靈敏性。另外，有證據表明RT-PCR檢測EML4-ALK可能會擴大假陽性［15］，即腫瘤組織和非腫瘤組織中都會出現ALK的重排。盡管RT-PCR有以上缺點，但仍然提倡使用RT-PCR的方法檢測EML4-ALK的融合基因。

2.2 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)

FISH是檢測ALK融合基因更加特異的方法，該分析方法在ALK基因斷裂點的對側使用2種不同的被標記探針，正常的ALK出現黃色標記，融合的ALK則表現紅色和綠色［16］。由于在應用FISH技術時，要用到甲醛固定，石蠟包埋等，這些技術會對組織形態造成破壞，因此盡管FISH是1種檢測肺腺癌中ALK重排的靈敏而獨特的手段，卻并不完全可靠。最新的一項研究表明［17］，1例ALK重排的肺腺癌利用免疫組化技術來檢測檢測ALK蛋白表達時，在使用FISH分析時誤診為ALK野生型。并且，FISH不能檢測不同種類的EML4-ALK融合。FISH現在用于PF-02341066(Crizotinib)的臨床試驗中，以≥15%的分離細胞核作為診斷ALK融合基因的標準。

2.3 免疫組織化學技術(immunohistochemistry，IHC)

IHC技術分析FFPE組織是當前外科病理實踐的主要方法，該方法的優點是可以在不損失用于鑒別正常與病理組織的細胞形態和結構特點的情況下檢測腫瘤特異性抗原的表達。幾種人類ALK蛋白的特異性抗體已經形成，并且有些經過IHC試驗，已廣泛地應用于診斷 ALK融合的漸變性大細胞瘤(ALCL)［18］。

Mino-Kenudson等［19］報道了1項關于IHC的實驗，該實驗使用提高FFPE中ALK蛋白表達靈敏性和特異性的抗體來分析174例腫瘤。通過試驗發現在22例ALK融合的肺腺癌患者中都表達了ALK蛋白，而在131例ALK為野生型的肺腺癌患者中未發現該蛋白。ALK融合的肺腺癌中ALK蛋白的表達水平比ALK融合的ALCL低，并且22例中的13例(59%)只有使用新式高靈敏度的IHC試驗才可以被檢測出。這些發現表明在ALK融合的肺癌中ALK的表達是受到限制的。這為在臨床病理醫生使用IHC試驗診斷適合ALK靶向治療的患者提供了可能性。但是存在ALK融合的組織中，即使使用最高靈敏度的IHC實驗，在活組織切片中其染色也可能不明顯，在這種情況下應該考慮FISH技術作進一步確認。

盡管在全球臨床實驗室中用IHC技術診斷ALK融合的ALCL，但是該技術并不能發現大多數ALK融合的肺腺癌，這是由于與ALK融合的ALAL相比，在ALK融合的非小細胞肺癌中ALK表達水平較低。為了克服這種限制，Takeuchi等［6］建立了1種插入式抗體強化聚合物(intercalated antibody-enhanced polymer，iAEP)方法，在ALK抗體和葡聚糖聚合物檢測試劑之間合并一個插入抗體。結果表明在免疫組化介導的EML4-ALK檢測中，使用 iAEP，在所有的 NSCLC樣本中均發現了已知的EML4-ALK陽性腫瘤。并且還發現了新的EML4-ALK亞型(亞型6(E18;A20)，亞型7(E14;A20))和一個新的ALK融合基因KIF5B-ALK。

目前還沒有公認的檢測EML4-ALK融合基因的金標準，上述的技術都各有優缺點，如何有效利用各種檢測分析技術簡單有效地檢測出該如何基因還有待進一步研究。

3 ALK抑制劑的使用

先前的研究發現在EML4-ALK融合基因陽性的肺癌中ALK的mRNA水平要高于該融合基因陰性的患者，因此抑制ALK激酶可能是臨床1種有效的治療方法［3］。臨床前研究表明，應用ALK抑制劑治療EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC時，關鍵性的信號傳導通路下調并出現細胞凋亡［20，21］。這與EGFR L858R突變NSCLC細胞株H3255使用EGFR抑制劑吉非替尼時觀察的結果相類似［22］。ALK抑制劑在體內試驗中的療效也得到評估，在由EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC細胞株產生的異種移植物模型中應用ALK抑制劑也可導致細胞的凋亡或者腫瘤的衰退縮減［23，24］。

PF-02341066(crizotinib)是口服的小分子ALK抑制劑，CrizotinibⅠ期臨床試驗開始于2006年5月。當發現EML4-ALK融合基因以及PF-02341066可以抑制ALK后，參與該臨床實驗的包括MET突變或者ALK14突變的患者。Kwak等［25］從1 500例NSCLC患者中發現82例(5.5%)攜帶1個ALK重排，在這些患者中使用1種新型的ALK激酶抑制劑:crizotinib(PF-02341066)進行臨床試驗。在平均治療時間為6.4個月中，該藥物有效率達57%(47/82)，46例部分緩解和1例完全緩解，27例病情穩定，該藥的副作用主要是輕度的胃腸道反應。該研究結果首次在2009年ASCL大會上報告。鑒于PF-02341066較高的有效率和較好的安全性，該藥被批準直接進入Ⅲ期臨床試驗，即使用crizotinib單藥與標準的二線化療(培美曲賽或多西紫杉醇)治療EML4-ALK陽性NSCLC隨機三期試驗;同時，不符合進入Ⅲ期臨床研究的EML4一ALK陽性NSCLC患者接受PF-0234561066單藥治療的Ⅱ期臨床研究。2011年ASCO對Crizotinib的I期臨床試驗結果進行了更新［26］，119例NSCLC患者使用PF-02341066治療時，中位無進展生存期達到10個月(95%CI:8.2 ～14.7)，客觀有效率為 61%(95%CI:52% ～70%)，中位有效應答時間為48 w，中位生存時間達1年的概率為81%。但是，Tanizaki等［27］發現盡管大多數EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC能從ALK抑制劑獲益，但是該藥物的療效在不同個體中有很大差別。在融合基因陽性的H3122細胞株中，ALK抑制劑TAE684通過抑制STAT3和ERK的磷酸化作用來抑制細胞的增殖，從而誘導細胞凋亡。在融合基因陽性的H2228細胞株中，TAE684只能抑制STAT3磷酸化，而不能抑制ERK磷酸化，對于細胞的增殖或者凋亡基本沒有影響，而MEK抑制劑可以聯合抑制STAT3和ERK通路從而誘導凋亡，因此，聯合使用TAE684和MEK抑制劑，對于STST3和ERK通路可以起到雙重抑制作用，從而下調抗凋亡蛋白存活素，上調促凋亡蛋白的表達。

4 ALK抑制劑的耐藥問題

隨著藥物的應用和研究的深入，ALK抑制劑將不可避免地出現耐藥性。Choi等［28］報道了1例EML4-ALK陽性的28歲非吸煙的男性NSCLC患者，在成功接受Crizotinib治療5個月后對該藥產生耐藥，并且研究者在該患者中發現兩處新的突變，即4374G→A和4493C→A。2個堿基突變分別導致了氨基酸C1156Y和L1196M的改變，從而影響ALK與Crizotinib或ATP的結合，并且L1196M突變導致的耐藥性比 C1156Y更強。Zhang等運用加速突變基因的策略來檢測對Crizotinib耐藥的ALK突變，應用體外基因掃描技術成功地檢測出L1196M，C1156Y和F1174L的改變，并且研究者使用1種更有效的ALK抑制劑TAE684來克服Crizotinib產生的耐藥［29］。最近，有研究表明 另 外 3 種 ALK 抑 制 劑 AP26113［30］，CH5424802［31］，X-396［32］都能選擇性地抑制 L1196M突變導致的耐藥。Ryohei Katayama等［30］為研究腫瘤細胞是如何產生耐藥，運用大劑量的Crizotinib作用于EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC的細胞系直至其產生耐藥，從而建立了耐藥模型，他們發現當產生耐藥性以后，EML4-ALK基因擴增，高劑量抑制劑使L1196M基因發生突變從而導致耐藥，在隨后的研究中，他們發現了另外2種結構不同的 ALK抑制劑，NVP-TAE684和 AP26113。其中，NVPTAE684明顯減少了H3122和H3122CR細胞系的存活力，這與H3122和H3122CR細胞系Crizotinib產生耐藥形成了鮮明的對比。而AP26113與Crizotinib相比，其在細胞內的作用強度高于Crizotinib5倍，同時AP26113在EML4-ALK陽性或者突變的Ba/F3細胞系中都表現出高度活性。同時，在二期試驗中，這些耐藥細胞對于Hsp90抑制劑17-AAG高度敏感。

EML4-ALK是NSCLC中1種新的分子靶點，EML4-ALK融合基因陽性的患者具有獨特的臨床病理特性，近期發現的EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變共存型患者中有許多尚未明確地問題值得研究，如不同病例對EGFR TKIs反應不一致的原因，采用何種藥物對基因共存體患者進行更好地靶向治療等。目前檢測EML4-ALK融合基因的技術有多種，但是還沒有1種金標準，如何應用更加靈敏準確的技術，檢測出該具有該融合基因的NSCLC患者更好地進行靶向治療是面臨的挑戰之一。初步的研究表明ALK抑制劑Crizotinib(PF-02341066)治療EML4-ALK陽性的NSCLC患者療效顯著，該藥物的Ⅲ期臨床試驗正在進行，隨著藥物的使用而不可避免的產生耐藥性也是值得關注的問題，有關耐藥的機制，耐藥后患者該如何進行治療等都需進一步研究，從而使患者更好地受益，真正實現個體化的靶向治療。

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