MicroRNA在炎癥性腸病中的研究現狀及應用于針灸調控機制研究的思考

豐曉溟,馬曉芃,吳煥淦,趙琛,劉慧榮

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海中醫藥大學針灸推拿學院,上海 201203)

克羅恩病(Crohn disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎癥性腸病的兩種主要類型,臨床表現相似,因長期腹痛、腹瀉、便血而影響患者身心健康。近年來,中國人 IBD發病率有上升趨勢。西醫治療以控制炎癥反應和緩解腸外癥狀為主,但本病發病機制尚不清楚,使得西醫學治療手段受限。中醫藥尤其是針灸對于IBD的治療有獨特優勢[1-3],但其調節機制尚有待于進一步揭示。MicroRNA(miRNA)是新近發現的具有調控 mRNA表達功能作用的小分子RNA,其對免疫系統細胞的發育分化[4-6]、炎性因子的產生[7]有重要調節作用,miRNA在炎癥性腸病發生發展中的作用已成為近年來研究的熱點。本文綜述miRNA在炎癥性腸病中的研究現狀,并探討從 miRNA角度研究針灸治療炎癥性腸病作用機制的意義和重要性。

1 miRNA的生物合成及生物學功能

miRNA首先在細胞核內由內含子轉錄為pri-microRNA轉錄子[8,9],后者經雙鏈的RNA核酸內切酶Drosha與DGR8整合,成為長約70個堿基對的莖環,即前體 microRNA(Pre-microRNA)[10]。Pre-microRNA通過輸出蛋白5轉運至胞漿,經Dicer核酸內切酶折疊為小的雙鏈RNA雙螺旋分子,成熟的miRNA整合到RNA誘導沉默復合物(RNA-inducing silencing complex,RISC)里。成熟的miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA,長度約22～24個核苷酸,通過識別特定的靶mRNA 的 3’ 非 編 碼 區(3’-untranslated region,3’-UTR)并與之互補配對,從而降解 mRNA或阻遏其翻譯,實現抑制蛋白編碼基因的表達。miRNA的表達模式具有高度保守性、時序性和組織特異性,在不同組織、不同發育階段中表達水平有顯著差異,是調控其他功能基因表達的重要分子。目前已知的人類基因組約有1500個miRNAs(http://www.mirbase.org/),對多達1/3的基因發揮著下調作用,一個miRNA能調控上百個蛋白編碼的 mRNA[11],而一個 mRNA又可受多個miRNA調控[12,13]。miRNAs可不被RNA酶降解,因而能在血漿和體液中有穩定表達[14]。大量的研究表明,miRNA可調節多種細胞過程,包括細胞周期、細胞分化增殖、凋亡、免疫功能等,從而參與發育調控、器官形成、腫瘤生成、免疫應答等生物學過程[15]。miRNAs參與免疫細胞的產生和分化、天然免疫和獲得性免疫應答反應,且與免疫系統疾病密切相關。對miRNAs的深入研究對生物進化探索、基因功能研究、人類疾病防治具有重要意義。

近年來IBD在中國發病率逐年上升,中國人UC發病率約為 11.6/105,CD發病率和患病率分別為0.848/105和2.29/105[16]。雖然CD和UC可通過病史、體格檢查、影像學、血清標志物、內鏡和組織化學等方法鑒別,但仍有 10%的結腸炎癥無法明確診斷。UC和CD病因尚未完全闡明,可能與患者遺傳易感性、腸黏膜微環境和腸道異常免疫應答有關,有明顯的遺傳危險因素模式和基因及蛋白表達特征[17-22]。基于miRNA在腫瘤發生,自身免疫調節中可能發揮的關鍵調節作用,提示miRNA可能成為IBD基因水平發病和治療的新靶點。與癌癥研究類似的是,目前miRNA在炎癥性腸病中的研究主要圍繞miRNA特異表達譜及診斷學指標的篩選。

2 miRNA在IBD中的研究現狀

炎癥性腸病受到復雜的基因網絡調控。由于mRNA數量龐大,研究其與炎癥性腸病的關系十分困難,難以系統地闡釋其復雜的相互關系。而目前發現的 miRNA數量相對較少,但功能龐大,研究miRNA對炎癥性腸病炎癥過程靶基因復雜網絡的調控更易闡釋。迄今為止,IBD中miRNA表達譜的研究主要包括IBD患者與健康人的差異表達譜,以及CD和UC患者的差異表達譜研究。盡管CD和UC患者臨床表現相似,但許多研究顯示兩者的發病機制并不相同,其差異不僅包含免疫反應的相關基因,還涉及纖維化、代謝、生物合成、細胞增殖和電解質轉運等多個過程的基因表達差異[19-25]。IBD研究的熱點主要集中在導致CD和UC發病差異的基因調控機制,而基因轉錄后調控引起的疾病表型差異也已引起關注,miRNA負向調控mRNA穩定性和蛋白翻譯過程就是一個重要的轉錄后調控機制。

2.1 IBD結腸中miRNA特異性表達譜研究

2008年的一項研究發現,與健康人比較,活動期UC患者結腸的 11個 miRNA有表達差異,其中 3個miRNA(miR-192,miR-375和 miR-422b)表達顯著降低,8個 miRNA(miR-16,miR-21,miR-23a,miR-24,miR- 29a,miR-126,miR-195和let-7f)表達顯著升高。而與健康人比較,非活動期 UC患者結腸 3個miRNA(miR-21,miR-375和 miR-422b)表達增高,4個miRNA(miR-23a,miR-16,miR-24和 miR-29a)表達降低[26]。其中miR-21是IL-6介導的STAT3依賴性miRNA家族,miR-192與促炎因子MIP-2a的表達呈負相關。這些差異至少提示兩點,一是 miRNA的異常調節可能通過促進活性促炎因子的釋放,而在UC發病中起關鍵作用;二是不同的 miRNA的表達差異可能參與結腸免疫平衡的調節和炎癥的維持。

另一臨床研究顯示[27],與健康人比較,活動期 CD患者乙狀結腸中 miRNA表達上調的有 miR-23b、miR-106和 miR-191,表達下調的有 miR-19b和miR- 629;而慢性活動期末段回腸 CD患者結果顯示,和健康人比較,miR-16、miR-21、miR-223和miR-594在末段回腸活檢樣本中表達上調。其中,miR-21在牛皮癬[28]和系統性紅斑狼瘡[29]報道有顯著上調;miR-223在克羅恩病及類風濕病人T細胞中[30]均有顯著上調。

以上結果顯示與健康人比較時,CD和 UC的差異miRNA表達譜較少重疊,提示miRNA參與UC和CD發病機制也是不同的。深入研究其機制,尚需揭示 miRNA與其靶基因的相互作用以明確miRNA的更多功能。

2.2 IBD外周血miRNA表達譜研究

IBD外周血miRNA特異性表達譜研究可能對IBD診斷學意義重大,可應用于診斷學指標的篩選。盡管腸鏡活檢能夠最直觀地反應結腸組織病變狀況,但是取腸組織活檢使其成為一種侵入性診斷方法。相比之下,循環血miRNA更易獲取,也易于被患者接受,更具有臨床診斷價值。研究顯示[31],活動期 CD患者外周血miR-362-3p表達最顯著,活動期 UC患者 miR-505、miR-103-2、miR-362-3p表達差異最顯著。且 11種miRNA可區分活動期UC和CD患者。但該結果與腸組織結果并不完全吻合,提示外周血與腸組織存在miRNA組織特異性表達,兩種組織的miRNA差異及功能尚需進一步研究。

另一項新研究發現希臘CD患者外周血中miR-16、miR-23a、miR-29a、miR-106a、miR-107、miR-126、miR-191、miR-199a-5p、miR-200c、miR-362-3p、miR-532-3p表達與健康人有顯著差異;UC患者外周血miR-16、miR-21、miR-28-5p、miR-151-5p、miR-155和miR-199a-5p與健康人表達有顯著性差異,其中UC患者的miR-155表達最高[32]。

IBD外周血miRNA表達的研究剛剛開展,以上研究提示不同人群的外周血篩選的 miRNA指標可能不同,若能在此基礎上進一步大樣本篩選出CD和UC患者外周血特異性表達的 miRNA,則可能會成為鑒別診斷 CD和UC的有效指標,從而提高臨床的診斷率。而不同種族的miRNA特異性表達譜在IBD患者中尚不多見,仍有待于臨床研究的進一步深入。

3 應用miRNA研究針灸調節IBD機制的思考

針灸對炎癥性腸病確有療效已得到臨床證實[33,34],機制方面的研究也提示針灸的調節作用是多水平、多靶點的。多項研究均顯示針灸能夠從基因水平調節炎癥性腸病,應用基因表達譜芯片技術研究UC大鼠結腸組織的基因表達譜,得到在UC大鼠結腸中異常表達、隔藥灸治療后得到調節的差異表達基因 174條,分析表明艾灸治療對基因表達的影響涉及細胞骨架運動相關基因、免疫相關基因(如 IL-1b、IGF-1等)、基礎代謝相關基因、炎癥相關基因等;對UC針灸調節分子免疫學機制的研究發現,隔藥灸與電針能夠降低潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜中 IL-1b、IL-6、IGF-l mRNA表達及iNOS mRNA表達,上調IL-1ra mRNA 表達,有效地控制UC已啟動的炎癥和免疫級聯反應,促進潰瘍的愈合[35];臨床研究也顯示,艾灸可能是通過下調 UC患者結腸黏膜IL-8 mRNA的表達,抑制ICAM-1mRNA表達,從而達到治療之目的[33,34]。對克羅恩病針灸調節分子免疫學機制的研究顯示,針灸能顯著降低模型大鼠結腸黏膜異常增高的TNF-a、IL-12、IFN-g、IGF-l mRNA表達;提升結腸黏膜異常降低的IL-4、IL-10 mRNA表達[36-38]。這些研究均提示針灸對 IBD的多個炎癥相關基因具有調節作用。

在此基礎上,應用數量較少、但功能龐大的miRNA研究針灸對炎癥性腸病炎癥過程靶基因復雜網絡的調控,將有助于全面深入地剖析針灸干預 IBD發生發展的作用機理,揭示針灸調節作用的分子基礎。目前尚未檢索到miRNA與中國人炎癥性腸病的關系及針灸干預作用的相關文獻報道。今后,可對中國人炎癥性腸病進行miRNA的篩選、鑒定,初步明確中國人炎癥性腸病相關的miRNA,了解中國人炎癥性腸病相關的miRNA表達特點,找出中國人潰瘍性結腸炎和克羅恩病發病的關鍵 miRNA及其靶基因,并運用生物信息學技術進行分析,構建 miRNA-mRNA的共表達網絡,對其參與的主要生物學功能和信號通路進行整合分析。并在此基礎上,觀察艾灸對于 miRNA及其靶基因的調節作用,運用生物信息學方法找出關鍵的信號通路中有顯著性差異的miRNA和 mRNA,繼而在細胞模型和動物模型上過表達和低表達相應的 miRNA,報告基因載體系統觀察其靶基因的表達狀況,明確miRNA的調節靶點,進而闡釋艾灸的治療機理。可以預見,引入miRNA技術研究針灸對IBD的調節機制,將傳統的中醫針灸與現代科學技術手段有機結合,將有助于全面、深入地揭示中醫針灸調節IBD的作用機制,必將推動IBD基礎研究和臨床治療的深入發展。

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