利用木薯酒糟液培養枯草芽孢桿菌的工藝優化

梅雪臣，黃加軍，曹玉飛，熊儒先，劉超帝，繆禮鴻*

（1.武漢工業學院 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.廣西中糧生物質能源有限公司，廣西 北海 536100）

木薯酒糟液是以木薯為原料發酵生產酒精蒸餾后的廢醪液，其COD達50000mg/L～100000mg/L，治理難度較大。酒糟中含有豐富的蛋白質和18種氨基酸，還有未被利用的脂肪、纖維素和酵母菌體等營養成分[1]。因此，對其進行開發利用，不僅能解決酒糟的污染問題，還能變廢為寶，實現資源的二次利用[2]。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是我國農業部允許作為飼料添加劑的安全益生菌之一，因其具有抗逆性強、代謝過程中可產生大量的蛋白酶、淀粉酶等有益因子現已在飼料領域得到廣泛的應用[3-4]。枯草芽孢桿菌還能有效降解水體中的氨氮和亞硝酸鹽等有害物質而具有凈化水質的作用，在養殖水體的生物修復方面具有廣泛的應用[5]。

高效、廉價的液體發酵培養基微生物制劑產業化的基礎。通過培養基及培養條件的優化以提高液體培養的活菌數對微生物制劑的生產具有重要意義[6-8]。本研究以枯草芽孢桿菌為研究對象，通過單因子和正交試驗對以木薯酒糟液為基礎的液態發酵培養基及其培養條件進行優化，為木薯酒糟液的資源化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：枯草芽孢桿菌BA1即水產養殖用枯草芽孢桿菌，為市購的某公司生產的商品化菌種，主要用于水產養殖；解淀粉芽孢桿菌T1和枯草芽孢桿菌A6由武漢工業學院資源與環境微生物研究室提供。

木薯酒糟液（pH4.2，COD 85000mg/L）：由廣西中糧生物質能源有限公司提供。

復合氮源營養液：含有機氮和氨基酸態氮，總氮含量9.70%。

1.2 培養基

1.2.1 木薯酒糟基礎發酵培養基

木薯酒糟液100%，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.2.2 木薯酒糟發酵培養基

木薯酒糟液98.8%，1.0%蔗糖，0.10%蛋白胨，0.10%（NH4）2SO4，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.2.3 牛肉膏培養基

牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000mL，pH 7.2～7.4。

1.2.4 碳源基礎發酵培養基

木薯酒糟液99.0%，蔗糖1.0%，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.2.5 氮源基礎發酵培養基

木薯酒糟液99.9%，蛋白胨0.10%，pH 6.0。115℃滅菌30min。

1.3 種子液的制備

將活化好的芽孢桿菌接種到牛肉膏液體培養基中，37℃、170r/min搖床培養24h。

1.4 活菌數測定方法

采用稀釋平板涂布計數法，菌懸液涂布于牛肉膏固體培養基平板后于37℃恒溫培養24h計數菌落數。

1.5 不同芽孢桿菌發酵酒糟液

采用木薯酒糟發酵培養基，調節培養基pH值至6.0。按5%接種量分別接種水產養殖用枯草芽孢桿菌BA1、解淀粉芽孢桿菌T1、枯草芽孢桿菌A6 種子液，培養溫度37℃，37℃、170r/min搖床培養24h，取樣測定培養液中芽孢桿菌的活菌數。并分別以木薯酒糟基礎培養基和牛肉膏培養基作為對照。

1.6 單因子試驗

1.6.1 發酵時間對芽孢桿菌菌數的影響

采用木薯酒糟發酵培養基，調節培養基至pH值為6.0。按5%接種量接種枯草芽孢桿菌BA1種子液，37℃、170r/min搖床分別培養18h、21h、24h、28h，取樣測定不同培養時間培養液中枯草芽孢桿菌的活菌數。

1.6.2 培養基pH值對水產養殖用枯草芽孢桿菌菌數的影響

采用木薯酒糟發酵培養基，用40%NaOH分別調培養基pH值至5.0、5.5、6.0、6.5，按5%接種量接種枯草芽孢桿菌種子液，37℃、170r/min搖床培養24h，測定各不同pH值培養液中枯草芽孢桿菌的活菌數。

1.6.3 接種量對枯草芽孢桿菌菌數的影響

采用木薯酒糟發酵培養基，調節培養基至pH值為6.0。分別按3%、5%、7%、10%接種量接種枯草芽孢桿菌種子液，37℃、170r/min搖床培養24h，測定不同接種量條件下培養液中的活菌數。

1.6.4 不同碳源對水產養殖用枯草芽孢桿菌活菌數的影響

選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入氮源基礎發酵培養基中，添加量均為1%。按5%接種量接種枯草芽孢桿菌BA1種子液，37℃、170r/min搖床培養24h，測定各培養液中枯草芽孢桿菌的活菌數。

1.6.5 不同氮源對枯草芽孢桿菌活菌數的影響

選擇蛋白胨、硫酸銨、尿素和復合氮源營養液4種氮源分別加入碳源基礎發酵培養基中，添加量均為0.1%。按5%接種量接種枯草芽孢桿菌BA1種子液，37℃、170r/min搖床培養24h，測定各培養液中草芽孢桿菌的活菌數。

1.7 正交試驗

通過上面單因子試驗，選擇2種氮源（尿素、復合氮源營養液）及2種碳源（葡萄糖、蔗糖）和3個濃度添加水平，采用L9（34）正交試驗法（表1）確定最佳培養基配方。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.8 離心干燥測活菌數

枯草芽孢桿菌BA1發酵菌液經4000r/min離心5min，棄上清得到離心沉淀菌體，取少量離心菌體進行稀釋平板測活菌數；剩余菌體經55℃恒溫干燥箱烘干、粉碎后制備成固體菌劑，并取樣測活菌數。

2 結果與分析

2.1 不同芽孢桿菌發酵酒糟液

采用木薯酒糟發酵培養基分別培養枯草芽孢桿菌BA1、A6菌株及解淀粉芽孢桿菌T1菌株。由表2可知，解淀粉芽孢桿菌T1在牛肉膏種子液中的菌數最高為11.2×108cfu/mL，而水產養殖用枯草芽孢桿菌BA1在木薯酒糟發酵液中的菌數最高為14.3×108cfu/mL。因此選定BA1菌株為后續試驗的發酵菌種。3株芽孢桿菌在不補加任何外源營養的木薯酒糟基礎培養基中的菌數均較低，因此，需要對以木薯酒糟液為基礎的發酵培養基進行優化，以便獲得更高的發酵活菌數。

表2 不同芽孢桿菌發酵酒糟液菌數比較Table 2 Viable counts of different Bacillus strains grown in cassava lees wastewater medium

2.2 單因子試驗

2.2.1 發酵時間對枯草芽孢桿菌菌數的影響

利用木薯酒糟發酵培養基，比較不同發酵時間對枯草芽孢桿菌BA1菌數影響。結果表明（圖1），發酵24h時BA1的活菌數最高，達17×108cfu/mL。因此，培養時間為24h為宜。

圖1 發酵時間對枯草芽孢桿菌BA1菌數的影響Fig.1 Effect of fermentation time on viable count of B.subtilis BA1

2.2.2 培養基pH值對枯草芽孢桿菌菌數的影響

由圖2可知，培養基的pH值為6.0時枯草芽孢桿菌BA1的活菌數最高，為最適宜生長的pH值，pH5.0、pH5.5和pH 6.5時的培養基活菌數明顯偏低。

2.2.3 種子菌懸液接種量對枯草芽孢桿菌菌數的影響

不同接種量的試驗表明（圖3），培養，接種量為5%時枯草芽孢桿菌BA1的活菌數最高，接種量為3%時BA1活菌數最低。接種量為5%、7%、10%時BA1的活菌數相差不大，但是考慮到經濟成本問題接種量為5%已經可以滿足發酵要求，因此最優接種量為5%。

圖2 培養基p H值對枯草芽孢桿菌BA1活菌數的影響Fig.2 Effect of pH value on viable count of B.subtilis BA1

圖3 接種量對枯草芽孢桿菌BA1活菌數的影響Fig.3 Effect of inoculum on viable count of B.subtilis BA1

2.2.4 不同碳源對枯草芽孢桿菌活菌數的影響

向木薯酒糟基礎培養基中分別補加4種碳源的試驗結果（圖4）表明，葡萄糖和蔗糖作為木薯酒糟液培養基的補充碳源最適宜芽孢桿菌BA1的生長，活菌數相對于糖蜜和可溶性淀粉高很多。

圖4 碳源對用枯草芽孢桿菌BA1活菌數的影響Fig.4 Effect of carbon source on viable count of B.subtilis BA1

2.2.5 不同氮源對枯草芽孢桿菌活菌數的影響

向木薯酒糟基礎培養基中分別補加4種氮源的試驗結果表明（圖5），添加復合氮源營養液時BA1活菌數最高，為最佳氮源。分別添加尿素和蛋白胨的培養基活菌數相當，但尿素的使用成本更低，因此正交試驗選擇復合氮源營養液和尿素作為補加氮源。

2.3 正交試驗優化結果

采用L9（34）正交試驗確定枯草芽孢桿菌BA1最適發酵培養基配方。由表3可知，極差R值的大小分別為C＞B＞A＞D，即對枯草芽孢桿菌生長影響由大到小依次為葡萄糖、復合氮源營養液、尿素和蔗糖。

圖5 氮源對枯草芽孢桿菌BA1活菌數的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on viable count of B.subtilis BA1

表3 正交試驗結果與分析Table 3 Result and analysis of orthogonal test

通過直觀分析和方差分析，理論上A3B1C2D1的組合為最優方案，但在9個試驗號中都沒有出現，正交表中A3B3C2D1的活菌數在9個試驗中最高，其次是A2B1C2D3。因此，選擇A3B1C2D1，A3B3C2D1，A2B1C2D3的組合進行驗證試驗，同時用牛肉膏培養基作為參比培養基，每個處理3次重復。由表5可知，A3B1C2D1的活菌數最高，達35.0×108cfu/mL，而牛肉膏液體培養液活菌數僅為12.0×108cfu/mL，其活菌數是牛肉膏液體培養基活菌數的2.9倍。與表2中數據比較，A3B1C2D1的活菌數分別為木薯酒糟基礎發酵培養基和未優化的木薯酒糟發酵培養基中活菌數的9.46倍和2.45。因此，枯草芽孢桿菌BA1的最佳補料配方為葡萄糖2.0%，復合氮源營養液0.10%，尿素0.30%，蔗糖1.0%。

2.4 離心干燥測數結果

按A3B1C2D1培養基配方發酵BA1，發酵液離心后測得新鮮離心沉淀菌體的活菌數為60×108cfu/g；離心沉淀菌體的含水率為84.0%。菌體經干燥、粉碎后得到的枯草芽孢桿菌菌劑實測活菌數為140×108cfu/g，與新鮮離心沉淀菌體的總菌數相比，干燥后菌劑的活菌數存活率明顯偏低，其原因有待進一步研究分析。

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

表5 驗證試驗（為3 次重復的平均值）Table 5 Verification experiment (Average number of 3 repeats)

3 結論

用木薯酒糟培養水產養殖用枯草芽孢桿菌BA1菌株，其最優培養基配方為木薯酒糟液96.6%，葡萄糖2.0%，復合氮源營養液0.10%，尿素0.30%，蔗糖1.0%，pH為6.0。最優培養條件為溫度37℃，搖床170r/min培養，培養24h。發酵結束后培養液中枯草芽孢桿菌BA1活菌數可達35.0×108cfu/mL，分別為木薯酒糟基礎發酵培養基和優化前的木薯酒糟發酵培養基中活菌數的9.46倍和2.45倍。發酵菌液經離心、干燥后得到枯草芽孢桿菌BA1菌劑的活菌數達140×108cfu/g。

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