牛奶中青霉素近紅外光譜定量分析

馬小紅，趙武奇*，谷 月，李曉丹，張 哲，田 蜜

（陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062）

牛奶含多種營養成分，被認為是“接近完善的食品”。在我國，隨著人們生活水平的提高，乳制品逐漸成為人民生活必需食品，這一消費需求有力地推動了乳品行業的發展。乳品行業成為我國新興而又極具發展潛力的食品行業，被社會公認為“朝陽產業”[1]。2010年，我國乳制品總產量2159萬t，比2005年增長79%，行業銷售額達到1717.50億元人民幣，利潤總額為89億元。但是我國目前乳品行業在發展機遇面前，卻面臨著乳品質量安全和生產加工過程的衛生狀況良莠不齊這一嚴重問題的干擾。抗生素殘留是目前影響乳制品質量安全的主要因素之一，抗生素通過食物鏈進入人體，對人體的健康構成嚴重的威脅。因此，聯合國糧農組織（FAO）、世界衛生組織（WHO）的食品法對牛奶中抗生素殘留量限量都有明文規定，歐盟（EC）和美國食品藥品監督管理局（FDA）也有嚴格規定，禁止抗生素殘留超過最高殘留限量的牛奶及制品上市。牛奶中抗生素殘留的檢測方法主要有微生物檢測法、理化檢測法和免疫學分析法，但這些檢測方法都具有不同程度的局限[2]。近紅外光譜（NIR）分析技術是20世紀70年代發展起來的一項高效、快速、無損、綠色的定性定量分析技術，已廣泛應用于石油化工、農業、制藥、食品、煙草工業、生命科學以及環境保護等領域[3]，在近紅外光譜檢測牛奶品質方面，COPPA M等[4]預測了牛奶中的脂肪酸組成，HSIEH CL等[5]預測了山羊奶的密度、脂肪及無脂固形物含量，BALABIN RM等[6]建立了液態奶中三聚氰胺的定量分析模型，李亮等[7]實現了對摻有植物性填充物牛奶的快速定性、定量鑒別，朱向榮等[8]對液態奶中蛋白質和脂肪含量進行預測，李曉云等[9]建立了牛奶中脂肪、蛋白質和干物質含量的定量分析模型。目前各養殖場特別是小規模奶牛飼養戶抗生素濫用現象十分嚴重，并且抗生素使用劑量也越來越大，造成抗生素在大部分牛奶中的有殘留。因此研究牛奶中抗生素的快速檢測方法具有現實意義，本文探討近紅外光譜無損檢測牛奶中青霉素的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

從超市購買3種不同廠家但是每種樣品為同批次的純牛奶。按國家標準GB/T4789.27-2003食品衛生檢驗方法微生物學檢驗方法氯化三苯四氮唑（TTC）法，對鮮牛奶中抗生素殘留進行檢測和結果判定[10]。篩選出不含抗生素的牛奶作為試驗的樣品。

青霉素標準品（純度96%），TTC（2，3，5-氯化三苯四氮唑，嗜熱乳酸鏈球菌，氯化三苯四氮唑，多功能近紅外光譜儀InfraXact（瑞典福斯公司）。

1.2 樣本集的制備

配置青霉素濃度分別為0、4×10-9g/L、10×10-9g/L、20×10-9g/L、30×10-9g/L、40×10-9g/L、50×10-9g/L、60×10-9g/L、70×10-9g/L、80×10-9g/L、90×10-9g/L、100×10-9g/L、120×10-9g/L、150×10-9g/L、180×10-9g/L、200×10-9g/L、220×10-9g/L、250×10-9g/L、280×10-9g/L、300×10-9g/L等不同梯度的84個牛奶樣本，為了更加接近于實際分析的樣品，將配置好的牛奶在4℃的冰箱里放置72h，對每一樣本進行近紅外光譜掃描。

1.3 樣品光譜采集

測量時，將樣品置于杯中，數據采集頻率為每次掃描3秒，光譜數據間隔為2nm，每個樣品重復掃描30次，通過計算機運行InfraXact光譜儀自帶的ISIscan軟件，獲取光譜數據并存儲。掃描前，儀器需預熱1h，自檢通過后方可正常使用。掃描過程中保持室溫25℃左右，并嚴格控制室內濕度，保持環境的一致性。

1.4 異常樣品的剔除及樣本集的劃分

利用馬氏距離剔除異常樣品，設置GH=3.0，含義為得分的三維圖中，每個樣品距離中心樣品點的距離為標準變異單位的3倍，馬氏距離超過3.0的被視為異常樣品，均被剔除。將經過異常剔除后的樣品按樣品序號采用隔八選一法進行分集，定標集和驗證集樣品個數比例約為7:1。

1.5 定標模型的建立

將不同的校正方法和預處理方法對模型的影響設計成正交試驗。選取L27（313）正交表[11]，將因素分別安排在1、2、4、8、11、13列進行試驗，以函數f=R/（1+SECV）為目標來評估模型的性能（R為定標決定系數，SECV為交叉驗證標準差），表1為試驗因素水平表。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor and levels of orthogonal test

1.6 定標模型的驗證

以驗證集樣品作為未知樣品進行預測，通過預測決定系數（R2）及預測集標準偏差（SEP）的大小來驗證模型的預測能力。

2 結果與分析

2.1 樣品的近紅外反射光譜圖

附圖為樣品的近紅外反射光譜圖。由光譜圖可以看出，液態奶制品的特征吸收波段大約在1200nm-1～1850nm-1內。青霉素中含有C=O、C-N、S-C、苯環等基團，在1200nm-1～1300nm-1內高倍頻吸收較弱，該區域包括C=O、C-N、S-C等鍵的伸縮振動吸收；在1300nm-1～1850nm-1區域的峰是由伸縮振動產生的吸收帶，苯環、C=C等鍵主要存在于此吸收波段，它是基團鑒定的區域也被稱為官能團區，豐富的光譜信息對牛奶中青霉素的近紅外光譜定量分析提供了大量的信息。

附圖 含青霉素牛奶的近紅外反射光譜圖Attached Fig.Near infrared reflectance spectrum of milk with penicillin

2.2 樣本集劃分結果

表2為樣本集劃分結果，可以看出校正集與驗證集的分布比較均勻，合理，具有較好的代表性，驗證集樣本也都被包容在校正集的空間內，滿足建立近紅外分析模型要求。

表2 樣本集劃分結果Table 2 Partitioning results of samples

2.3 正交試驗結果

由表3可以得出，牛奶中青霉素的最佳水平組合為A3B2C2D3E3F3，即定標方法為改進偏最小二乘法（MPLS），散射校正為標準正常化+趨勢變化法散射處理（SNV+D），導處理為1階、導數處理間隔點為8、平滑處理間隔點為8，二次平滑處理間隔點為8。

2.4 模型的適用性檢驗

模型建立后，用驗證集對模型進行驗證。驗證結果如表4。

由表4可以看出，青霉素檢測的最佳模型的決定系數R2為0.975，具有很高的相關性。相對標準差為12.87略大于10%，但相對分析誤差為6.1758大于3，說明取得了良好的預測效果，所建立的定標模型可用于實際檢測，可看出所建立的模型有較好的預測性和適用性[12]。

3 結論

通過以上試驗表明：利用近紅外技術可以快速無損的檢測出牛奶中抗生素的含量，且其精度能達到ppb級（μg/L）。利用近紅外光譜技術快速無損的測定牛奶中抗生素的含量的技術在牛奶市場上具有很高的利用價值，可以實現生產線上的在線檢測。如將該技術應用于測定牛奶甚至是其他食品中各種成分尤其是有害成分的微量測定將會更有意義。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 最優模型驗證結果Table 4 Validation results of optimal models

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