不同泥厚窖池窖泥主要功能菌及代謝產(chǎn)物研究

姚萬(wàn)春，唐玉明，任道群，劉茂柯，雷光電，易 彬

（1.四川省農(nóng)科院水稻高粱研究所，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646003）

濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ)，窖泥質(zhì)量不僅在于其理化指標(biāo)豐富程度，更取決于有益功能菌的數(shù)量、活性及產(chǎn)物的代謝能力[1]。窖泥中棲息著大量的微生物菌群，其為嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧微生物，而窖泥中微生物種類(lèi)、數(shù)量及其代謝是直接影響白酒質(zhì)量的關(guān)鍵所在[2]。發(fā)酵過(guò)程棲息在窖池窖泥、糟醅中的龐大微生物群落在糟醅固、液、氣三相界面進(jìn)行著復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過(guò)程。

發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的黃水充當(dāng)著窖泥與糟醅物質(zhì)交換的載體，封窖發(fā)酵形成的窖內(nèi)壓力變化使酒糟中的養(yǎng)分和來(lái)自曲藥、環(huán)境中的微生物及代謝產(chǎn)物，不斷通過(guò)黃水進(jìn)入窖泥，而窖泥中長(zhǎng)期馴化的微生物種群及其代謝產(chǎn)物又不斷地進(jìn)入糟醅中，物質(zhì)能量交換不斷地影響著窖泥生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)窖泥老熟和酒質(zhì)的提高[3]。然而，特定的地理、氣候、泥壁厚度等環(huán)境條件造就了特定的微生物生長(zhǎng)環(huán)境[4-5]。所以不同酒廠生產(chǎn)的白酒呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味和品質(zhì)。

因此，分析窖泥中主要功能菌群的分布特征和群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于研究中國(guó)白酒風(fēng)味因子形成機(jī)理、有效地控制生產(chǎn)環(huán)境條件和名優(yōu)白酒生產(chǎn)的品質(zhì)，有著積極的意義。本文通過(guò)對(duì)不同壁厚窖池中窖泥主要功能菌群及其代謝產(chǎn)物的分析，探討窖池建造厚度對(duì)窖泥質(zhì)量的響。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

樣品采自瀘州老窖酒廠不同建窖厚度的窖泥。

1.2 取樣方法

在窖池的窖壁四周各分5點(diǎn)分別取樣，然后混勻。

1.3 培養(yǎng)基

厭氧菌培養(yǎng)基（aerobic culture medium）[6]：胰酪蛋白胨20g/L，氯化鈉5g/L，L-半胱氨鹽酸鹽（L-Cysteine hydrochloride）0.4g/L，硫基乙酸鈉2g/L，葡萄糖10g/L，甲醛合次硫酸氫鈉10g/L，美蘭（similan）0.002g/L，瓊脂20g/L。pH 7.3～7.5。

甲烷菌培養(yǎng)基[7]：甲酸鈉2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，氯化銨1.0g/L，氯化鎂0.1g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L，磷酸二氫鉀0.4g/L，酵母膏2.0g/L，胰化酪蛋白2.0g/L，鹽酸半胱氨酸0.5g/L，刃天青（0.1%）1mL/L，甲醇5mL/L，微量元素液10mL/L，瓊脂20g/L。

已酸菌培養(yǎng)基[8]：乙酸鈉5.0g/L，酵母膏1.0g/L，硫酸銨0.5g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L，硫酸鎂0.2g/L，碳酸鈣10g/L，瓊脂20g/L。pH 7.0～7.2。碳酸鈣單獨(dú)滅菌，接種前加入，同時(shí)加入乙醇2mL/L。

丁酸菌培養(yǎng)基[9]：胰蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏5.0g/L，葡萄糖4.0g/L，酵母膏3.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，鹽酸半胱氨酸0.5g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，硫酸鎂0.4g/L，氯化鈣0.2g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，瓊脂20g/L。pH 7.0～7.2。

丙酸菌培養(yǎng)基（BPYL）[10]：牛肉膏5g/L，蛋白陳10g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，乳酸鈉20g/L，瓊脂20g/L。pH 7.0～7.2。

1.4 窖泥微量成分分析

準(zhǔn)確稱取一定量的窖泥，加適量的乙醇研磨，定容后浸提一定時(shí)間，將上清液用微孔濾膜過(guò)濾，采用氣相色譜法測(cè)定微量成分[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中窖泥主要功能菌群的變化趨勢(shì)

要釀制優(yōu)質(zhì)濃香型白酒，就必須了解優(yōu)質(zhì)窖泥中的主要微生物體系，了解并掌握了這個(gè)復(fù)雜的菌系，有助于制定工藝條件，促進(jìn)釀酒有益菌的生長(zhǎng)，以提高酒質(zhì)[12]。因而，對(duì)不同建窖厚度的濃香型白酒窖池的窖泥主要功能菌群進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖5。

[30][35][38] 曹子陽(yáng)、吳志峰、匡耀求、黃寧生：《DMSP/OLS夜間燈光影像中國(guó)區(qū)域的校正及應(yīng)用》，《地球信息科學(xué)學(xué)報(bào)》2015年第9期，第1092-1102頁(yè)。

圖1 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中厭氧菌數(shù)的變化曲線Fig.1 Variation of anaerobic bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖2 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中己酸菌數(shù)的變化曲線Fig.2 Variation of caproic acid bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖3 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中丁酸菌數(shù)的變化曲線Fig.3 Variation of butyric acid bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖4 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中甲烷菌數(shù)的變化曲線Fig.4 Variation of methano bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖5 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中丙酸菌數(shù)的變化曲線Fig.5 Variation of propion bacterium number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

由圖1～圖5可以看出，不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中窖泥主要功能菌群的分布存在以特點(diǎn)：

厭氧菌：從圖1看出，10cm 建窖厚度窖池，第1排發(fā)酵過(guò)程窖泥中的厭氧菌數(shù)雖然大幅減少，但在過(guò)后的發(fā)酵過(guò)程中快速增加。5cm和15cm建窖厚度窖池，前1～2排發(fā)酵過(guò)程窖泥中的厭氧菌數(shù)都減少，第三排發(fā)酵過(guò)程才回升。到第3輪釀造時(shí)，10cm的菌數(shù)最多，明顯多于建窖當(dāng)日；5cm的菌數(shù)居中，與窖當(dāng)日接近；15cm的菌數(shù)最少，明顯少于建窖當(dāng)日。說(shuō)明人工窖泥培養(yǎng)過(guò)程中，由于環(huán)境條件的限制，除了厭氧和兼氧微生物大量繁殖外，還繁殖了不少的好氧菌。入窖后，由于窖內(nèi)環(huán)境的改變，部分微生物因不能適應(yīng)環(huán)境而快速死亡，部分微生物因條件適宜而緩慢生長(zhǎng)。這就造成人工窖泥建窖后前1～2排發(fā)酵過(guò)程中厭氧菌數(shù)量減少，過(guò)后逐漸增多的結(jié)果。

己酸菌：5cm和10cm建窖厚度窖泥的己酸菌數(shù)的變化趨勢(shì)相同，均是前1～2排發(fā)酵過(guò)程菌數(shù)逐漸減少，第3排發(fā)酵時(shí)菌數(shù)逐漸增加，到第3輪釀造時(shí)菌數(shù)均已超過(guò)建窖當(dāng)日。這時(shí)10cm的己酸菌數(shù)多于5cm。15cm建窖厚度的己酸菌數(shù)在1～3排發(fā)酵過(guò)程中變化規(guī)律性不強(qiáng)，總的呈下降趨勢(shì)。

丁酸菌：5cm和15cm建窖厚度窖泥的丁酸菌數(shù)的變化趨勢(shì)相同，均是第1排釀造過(guò)程中增加，第2排釀造過(guò)程中減少，第3排釀造過(guò)程中又增加。10cm建窖厚度窖泥的丁酸菌數(shù)在第1排釀造過(guò)程中菌數(shù)逐漸減少，但之后菌數(shù)逐漸增加。第3排釀造時(shí)，以10cm建窖厚度窖泥的丁酸菌數(shù)最多。

甲烷菌：3種建窖厚度窖池在前3排發(fā)酵過(guò)程的甲烷菌數(shù)變化趨勢(shì)各不相同，分別是：5cm厚度菌數(shù)逐排下降；10cm厚度第1排發(fā)酵菌數(shù)下降，之后漸漸增加，到第3輪釀造時(shí)已超過(guò)建窖當(dāng)日；15cm厚度菌數(shù)是第1排發(fā)酵下降，第2排發(fā)酵回升，第3排發(fā)酵又略有下降。到第3輪釀造時(shí)15cm和10cm的菌數(shù)接近，明顯多于5cm。

丙酸菌：在前3排發(fā)酵過(guò)程中，5cm建窖厚度窖泥的丙酸菌數(shù)變化不大，到第3輪釀造時(shí)與建窖當(dāng)日接近；10cm建窖厚度窖泥的丙酸菌數(shù)是逐排發(fā)酵增加，到第3輪釀造時(shí)，比建窖當(dāng)日提高50%左右；15cm建窖厚度窖泥的丙酸菌數(shù)前兩排發(fā)酵增加，且增幅大于10cm厚的建窖泥，但第3排發(fā)酵菌數(shù)又出現(xiàn)下降，以至到第3輪釀造時(shí)菌數(shù)還略少于10cm。

圖1～圖5表明了主要功能群在不同建窖厚度窖池中棲息分布的規(guī)律，對(duì)于進(jìn)一步了解、研究窖泥微生物群落變化、生態(tài)分布及對(duì)比認(rèn)識(shí)這些微生物群落同產(chǎn)酒效應(yīng)均有一定意義[13]。

2.2 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中窖泥的微量化學(xué)生態(tài)環(huán)境變化

窖泥理化成分的多態(tài)性變化，如水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素等的變化，還有微生物多態(tài)性引起的代謝產(chǎn)物，這些復(fù)雜的代謝產(chǎn)物與窖泥自身的無(wú)機(jī)化學(xué)成分多態(tài)性又引起發(fā)酵環(huán)境變化的多態(tài)性從而導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境中酶類(lèi)和酶系及其他代謝產(chǎn)物的多態(tài)性變化[14]。對(duì)不同建窖厚度窖池窖泥的微量化學(xué)成分進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖6～圖11。

圖6 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中己酸含量的變化曲線Fig.6 Variation of caproic acid content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

己酸含量：3種建窖厚度窖池前3排發(fā)酵窖泥中己酸含量變化趨勢(shì)各不相同，其中5cm厚度是前1～2排發(fā)酵逐漸降下降，第3排發(fā)酵小幅回升，但到第3輪釀造時(shí)仍低于建窖當(dāng)日；10cm厚度是第1排發(fā)酵增加，第2排發(fā)酵過(guò)程下降到建窖當(dāng)日水平，第3排發(fā)酵過(guò)程又上升。15cm建窖厚度窖泥第1排發(fā)酵過(guò)程下降，第2、3排發(fā)酵過(guò)程緩慢回升。第3排釀造時(shí)10cm和15cm的含量接近，遠(yuǎn)高于5cm。

圖7 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中己酸乙酯含量變化曲線Fig.7 Variation of caproic acid ethyl ester content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖8 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中酯類(lèi)化合物含量的變化曲線Fig.8 Variation of ester compound content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖9 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中酯類(lèi)化合物種類(lèi)的變化曲線Fig.9 Variation of ester compound types in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

己酸乙酯含量：3種建窖厚度窖池前3排發(fā)酵窖泥中己酸乙酯含量變化趨勢(shì)各不相同，但總的呈上升趨勢(shì)。3種建窖厚度己酸乙酯含量變化趨勢(shì)分別是：5cm是前1～2發(fā)酵勻速增加，第3排發(fā)酵下降；10cm是逐排發(fā)酵增加，其中第1排發(fā)酵增速最快；15cm是第1排發(fā)酵略有增加，第2排發(fā)酵大幅增加，但第3排發(fā)酵又大幅降低。到第3輪釀造時(shí)，10cm的含量略高于5cm，明顯高于15cm。

圖10 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中總微量化合物含量的變化曲線Fig.10 Variation of trace compound content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

圖11 不同建窖厚度窖池發(fā)酵過(guò)程中總微量化合物種類(lèi)的變化曲線Fig.11 Variation of trace compound types in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

酯類(lèi)化合物：3種建窖厚度窖泥中酯類(lèi)化合物含量和種類(lèi)與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系均是呈曲折上升的趨勢(shì)。其中，10cm和15cm 2種建窖厚度窖泥的酯類(lèi)化合物的含量和種數(shù)變化趨勢(shì)相似，均是隨發(fā)酵排次增加而增加，且二者的數(shù)值接近；5cm建窖厚度窖泥的酯類(lèi)化合物含量和種數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中變化無(wú)規(guī)律，在第2排發(fā)酵時(shí)酯的種類(lèi)略有下降，而含量相反大幅增加，在第3排發(fā)酵過(guò)程中種數(shù)增加，而含量相反降低；到第三輪釀造時(shí)，10cm和15cm的酯類(lèi)化合物含量和種類(lèi)接近，均高于5cm。

微量化合物：在5cm和10cm建窖厚度窖泥中，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)含量緩慢增加，但10cm的增速略大于5cm；在15cm建窖厚度窖泥中，前兩排隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)含量增加，尤其是第2排發(fā)酵時(shí)含量大幅增加，但第3排發(fā)酵時(shí)含量有所降低，到第3輪釀造時(shí)還略少于10cm的含量。

3種建窖厚度窖泥的微量化合物種數(shù)變化規(guī)律相同，總的呈上升趨勢(shì)。第1排發(fā)酵時(shí)增幅較大，第2排發(fā)酵時(shí)小幅下降，第3排發(fā)酵時(shí)又開(kāi)始回升。10cm建窖厚度窖泥中微量化合物種類(lèi)，除第1輪釀造時(shí)居于5cm和15cm之間外，其余輪次釀造時(shí)均為最高。

濃香型白酒窖泥中除上述主要功能菌群和微量化學(xué)成分外，還有許多的有益微生物和復(fù)雜成份，況且其還會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的變化而發(fā)生變化，對(duì)白酒的風(fēng)格及個(gè)性特點(diǎn)起著重要作用，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的風(fēng)格和個(gè)性作以一科學(xué)的總結(jié)，找出規(guī)律，還需要同仁們做大量的工作。

3 結(jié)論與討論

優(yōu)質(zhì)的人工窖泥、良好的生態(tài)環(huán)境、優(yōu)化的窖池結(jié)構(gòu)、科學(xué)的生產(chǎn)工藝是快速提高新建窖池基酒質(zhì)量的有效保。生產(chǎn)濃香型酒的窖池是一個(gè)特殊的微生物生態(tài)環(huán)境，微生物生態(tài)的特殊性造成了窖泥微量化學(xué)生態(tài)環(huán)境的特殊性，酒窖窖泥的微生物區(qū)系生態(tài)結(jié)構(gòu)和微量化學(xué)生態(tài)是生產(chǎn)名優(yōu)白酒的基礎(chǔ)[15]。通過(guò)對(duì)濃香型酒不同建窖厚度窖泥中主要功能菌群分布和微量化學(xué)成分變化研究，初步得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：

（1）人工窖泥建窖后無(wú)論何種厚度的窖池第1排發(fā)酵過(guò)程中主要窖泥功能菌數(shù)幾乎都減少；10cm建窖厚度的窖泥主要功能菌數(shù)從第2排發(fā)酵起就隨著發(fā)酵排次的增加而增多；5cm和15cm的部分主要窖泥功能菌數(shù)在第2排發(fā)酵過(guò)程中繼續(xù)減少，到第3排發(fā)酵時(shí)仍有極少數(shù)功能菌呈下降趨勢(shì)。到第3輪釀造時(shí)，10cm建窖厚度的窖泥主要功能菌數(shù)都明顯多于建窖當(dāng)日，而5cm和15cm 2種建窖厚度的主要窖泥功能菌數(shù)除少數(shù)與建窖當(dāng)日接近外，多數(shù)低于建窖當(dāng)。

（2）5cm與15cm 2種建窖厚度窖池的厭氧菌數(shù)和丁酸菌數(shù)變化趨勢(shì)相同，5cm與10cm 2種建窖厚度窖池的丙酸菌數(shù)和己酸菌數(shù)變化趨勢(shì)相同，10cm與15cm 2種建窖厚度窖池沒(méi)有變化趨勢(shì)相同的窖泥功能菌。3種建窖厚度窖池的甲烷菌數(shù)變化趨勢(shì)各不相同。

（3）3種建窖厚度窖池前3排發(fā)酵過(guò)程中，除己酸含量變化不大外，己酸乙酯、酯類(lèi)化合物和總微量化合物的含量都是呈曲折上升的趨勢(shì)，其中己酸乙酯與酯類(lèi)化合物的含量變化趨勢(shì)接近，且增加幅度明顯大于總微量化合物。

（4）前3排發(fā)酵過(guò)程中3種建窖厚度窖池窖泥中酯類(lèi)化合物種類(lèi)和總微量化學(xué)成分種類(lèi)的變化趨勢(shì)均是曲折緩慢上升，且都是10cm與15cm的接近，這二者多于5cm。

（5）采用5cm、10cm和15cm 3種厚度建造濃香型白酒窖池，作為微生物的棲息容器都能起到吸附菌體、濃縮營(yíng)養(yǎng)、向酒醅滲透揮發(fā)性微量成分的作用[16]，但是窖池的建造厚度對(duì)窖泥質(zhì)量有明顯影響。

上述研究結(jié)果結(jié)合生產(chǎn)成本綜合考慮，建議濃香型白酒窖池建造泥壁厚度以10cm為宜。

[1]吳亦波，王振環(huán)，方躍進(jìn)，等.利用現(xiàn)代生物技術(shù)科學(xué)培養(yǎng)窖泥，快速提高新建窖池基酒質(zhì)量[J].中國(guó)釀造，2012，31（5）：172-175.

[2]周恒剛.漫談己酸菌與窖泥[J].釀酒，1998（3）：1-5.

[3]胡 承，應(yīng) 鴻，許德富，等.窖泥微生物群落的研究及其應(yīng)用[J].釀酒科技，2005（3）：34-38.

[4]姜明軍，宋和付，陳安國(guó)，等.濃香型白酒窖泥中重要微生物的分析與研究[J].湘潭礦業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003（4）：91-94.

[5]沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

[6]董國(guó)賓，李俊芝.幾種主要厭氧菌培養(yǎng)基的制備與作用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，20（4）：25-26.

[7]吳衍庸，薛堂榮，陳昭蓉，等.五糧液老窖厭氧菌群的分布及其作用研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1991（4）：299-307.

[8]盧中明，姚萬(wàn)春，唐玉明，等.不同配方人工窖泥微量揮發(fā)性成份研究[J].釀酒科技，2011（3）：16-19.

[9]趙建新，張 灝，田豐偉，等.丁酸菌的分離、鑒定及篩選[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002（6）：597-601.

[10]樂(lè)華愛(ài)，金石云，蘇京軍，等.丙酸發(fā)酵的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1990（1）：15-17.

[11]馬 蓉，姚萬(wàn)春，唐玉明，等.不同窖齡窖泥微量揮發(fā)性成份研究[J].釀酒，2011（3）：46-49.

[12]楊鵬舉.窖泥中微生物菌群及其代謝模式[J].釀酒科技，1995，68（2）：14-15.

[13]吳衍庸，齊義鵬，徐成基，等.瀘州大曲酒窖泥中微生物的生態(tài)分布和嫌氣發(fā)酵特征[J].微生物學(xué)通報(bào)，1980（3）：20-23.

[14]涂向勇，姚繼承.窖泥與基酒成分關(guān)系的比較研究[J].釀酒科技，2009，185（11）：90-93.

[15]張宗奇，張 旭.對(duì)濃香型白酒個(gè)性特點(diǎn)探討[J].釀酒科技，2009，176（2）：68-70.

[16]蔡鵬飛，邵傳貞，姚慶樂(lè)，等.窖泥在釀酒中的兩個(gè)作用[J].釀酒，2011（5）：18-20.