郫縣豆瓣高酶活米曲霉選育鑒定及復合菌制曲改善酶系組成研究——郫縣豆瓣高酶活米曲霉的選育鑒定

李 峰，趙 萍，周昌豹，宋 萍，張蓓蓓

（四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130）

郫縣豆瓣是我國傳統特色發酵食品的典型代表，歷史悠久，為中華傳統生物食品產業之瑰寶，是源自中國本土的生物技術產業，是全國著名的地理標志產品。郫縣豆瓣因紅潤光亮、醬香濃郁、味辣香醇、瓣粒酥脆、黏稠絨實等優點受到消費者青睞，堪稱川菜之魂。其依賴四川優越的氣候、地理、環境、人文、飲食條件及獨創性的生產技藝，歷經300多年的演變、沉淀、錘煉、升華，自成一家、長盛不衰，深受國內外消費者喜愛和同行的廣泛關注與認同。非物質文化遺產郫縣豆瓣于2000 年4 月21 日獲得國家工商總局商標局批準的“郫縣豆瓣”地理標志證明商標，并獲得中國馳名商標等榮譽稱號。目前郫縣豆瓣從傳統的烹飪調料發展到系列復合調味品：火鍋底料、燒菜調料、魚調料、飯掃光、佐料系列等新產品，銷售遍布全國各省、市，并出口美國、加拿大、新西蘭、日本等國家。

1 材料和試劑

豆瓣樣品：從郫縣豆瓣生產企業采集樣品。

培養基：菌落分離采用PDA培養基；菌種鑒定采用察氏培養基。

PDA培養基：馬鈴薯削皮，切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1000mL，pH值自然，121℃菌20min。

察氏培養基：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，氯化鉀0.5g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，加熱溶解，分裝后121℃滅菌20min。

固體培養基：按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的水，拌勻。121℃、0.1 MPa滅菌45min。

主要試劑：福林試劑（Folin試劑）、二硝基水楊酸（DNS）試劑均為實驗室自配、Tris-HCl，EDTA，PCR擴增產物純化試劑盒等；蠶豆、麩皮、豆粕均購自農貿市場；其他試劑均購自成都百旺化學試劑公司。

2 儀器和設備

主要儀器：752型紫外可見分光光度計，HH-600（0）型電子恒溫水浴鍋，LXJ-II離心沉淀機，PHS-3C型精密pH計，LRH-250A型生化培養箱，XS-18型光學顯微鏡，Bio-rad PCR儀，Thermo小型離心機，電泳儀，搖床，超凈工作臺。

3 實驗內容和方法

3.1 米曲霉的分離純化

無菌條件下，將曲搗碎，稱取適量樣品，選取適宜的稀釋度用生理鹽水稀釋，采用含青霉素100單位/mL的PDA培養基，采用稀釋涂布平板法。每個稀釋接種3個平板，放置于30℃的培養箱內培養至48h，進行觀察，將菌落形態不同的菌種分離，各自傳代培養，至少進行3次傳代分離，得到純化菌種，保存菌種備用。

3.2 高酶活米曲霉的篩選

將純化好的單個菌株接入到固體發酵培養基中，按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的水，拌勻。121℃、0.1MPa滅菌45min，冷卻后分別接入菌種，在30℃恒溫培養72h。以酸性蛋白酶、中性蛋白酶和淀粉酶活力作為復篩的標準，篩選出酶活相對較高的米曲霉菌株。

3.3 菌種鑒定

對篩選出的菌株采用劃線平板培養后進行培養特征的觀察。菌體特征及孢子結構觀察從菌落上挑取菌絲及產孢結構，制普通玻片進行光學顯微鏡觀察；根據篩選菌株的菌落、菌絲、抱子形態顯微鏡照片特性進行鑒定。

3.4 酶活力測定

3.4.1 蛋白酶測定方法

粗酶液制取方法：上述制得固體曲樣品中按重量加入1:20（w/v）的緩沖溶液，于40℃水浴中浸提1h，間歇攪拌，過濾得粗酶液。此粗酶液用于各種蛋白酶酶活性測定。

酶活測定方法：采用福林酚法。

3.4.2 淀粉酶測定

樣品處理：酶液提取方法同蛋白酶測定，取5mL粗酶液，在7000r/min離心30min，吸取上清液測定酶活性。

酶活測定方法：參照SOMOGYI M的方法進行測定。

3.5 菌株DNA的提取

（1）取適量菌絲，加入500mL 5×CTAB，再加適量的玻璃珠，漩渦振蕩器上高速振蕩4min～5min。

（2）65℃保溫20min，每隔10min搖勻1次。

（3）加入等體積氯仿:異戊醇（24:1，v/v），12000r/min離心10min。

將上清液移入新的離心管中，重復此步驟。

（4）在上清中加入2倍體積預冷的無水乙醇，-20℃靜置20min～30min，12000r/min離心10min。

（5）倒掉上清，加70%vol的酒精200mL洗沉淀，室溫干燥。

（6）加入100mL TE使DNA完全溶解；加入RNase A（10mg/mL），65℃保溫30min。

（7）重復步驟4～6。最后DNA 溶于30mL超純水。

3.6 PCR擴增

根據真菌整個ITS區設計通用引物序列為：

正向引物：ITS4：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’反向引物：ITS5：5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，以霉菌的DNA基因組為模板，擴增ITS序列。

PCR擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，進行35個循環，最后72℃延伸10min。

3.7 PCR產物的電泳

進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。90V電壓條件下，電泳40min。

4 結果分析

4.1 酶活力測定

將篩選出的菌種ddQ-125和jcQ-93進行蛋白酶活力和淀粉酶活力測定，對照菌是市售曲精C結果見圖1。

圖1 米曲霉菌種的酶活力Fig.1 Enzyme activity of the Aspergillus oryzae strain

由圖1可知，菌株ddQ-125酸性蛋白酶活力最強，菌株jcQ-93的中性蛋白酶和淀粉酶的酶活力較菌株最強，酶活力均高于對照市售曲精C。

4.2 菌種的形態學觀察

經平板篩選和分離純化，從郫縣豆瓣生產企業收集樣品中分離篩選出2株霉菌，編號為ddQ-125和jcQ-93。

圖2 菌種的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of strains

菌株ddQ-125和jcQ-93的菌落、菌絲和抱子形態如圖2，在PDA培養基上，25℃培養7d，產出黃色或黃綠色孢子，菌落表面絮狀、邊緣白色絨毛狀。菌落蔓延迅速，初為白色，后變成黃綠色或黃褐色。背面無色或中央略帶黃褐色。分生抱子梗自基質中伸出，分生孢子穗半圓形，小梗1層或2層；頂囊半球形、圓拱形以至球形；分生孢子球形。通過形態和顯微觀查結果，初步鑒定這兩株菌為米曲霉。

4.3 PCR反應結果

將反應后的PCR產物于1.0%瓊脂糖緩沖系統，90V電壓條件下，電泳40min，用凝膠成像系統觀察并攝影記錄。所有菌株都產生單一的明亮條帶，且所有的條帶均為所需條帶的長度，正好為目的片段的長度，見圖3。

圖3 菌株ddQ-125和jcQ-93的rDNA-ITS部分序列的PCR擴增電泳圖Fig.3 Electropherogram of strain ddQ-125 and jcQ-93 partial sequences of rDNA-ITS PCR amplification

4.4 菌株的ITS序列分析

4.4.1 ddQ-125菌株擴增ITS部分基因序列

CGAAGGACATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAG CCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTG TACCTTAGTT G CTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGG GCTCTCAGCCCCGGGC CCGCGCCCGCCGGAGACA CCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTT GATTGTA TCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATG GATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCG TGAATCATCGAGTCTTTGAACG CACATTGCGCCCC CTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCA TTGCTGCCCATC AAGCACGGCTTGTGTGTTGGGT CGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAG GCA GCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTAT GGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCC GGCCGGC GCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGG ATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAG GGAGGAAA

4.4.2 jcQ-93菌株擴增ITS部分基因序列

CTACCTGATCCGAGGTCACCTGGAAAAAGGATGAT TTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGG CCTACAGAGC GGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACG CGGTGCCGCCGCTGC CTTTGGGGCCCGTCCCCCCC GGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGC TTGAT GGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCC CCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGT TCAAA GACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTA GTTATCGCATTTCGCTGCG TTCTTCATCGATGCCGG AACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATT GCGATA AATCAACTCAACTTCACTAGAATCAGACA GAGTTCGTGGTGTCTCCGGCG GCGCGGGCCCGGGG CTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCG CCGAAGCAACTAAGGTACAG TAAACACGGGTGGG AGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAAT GATCCTTCCGC AGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTA CG

采用真菌通用R/F引物擴增米曲霉ITS部分序列。經PCR擴增測序進一步鑒定其中ddQ-125和jcQ-93菌株確屬于Aspergillus oryzae；將測得的A、B菌株的ITS序列在Gen-Bank數據庫中進行同源序列比對。結果顯示，兩菌株與米曲霉的ITS序列相似性達到99%以上。

5 結論

從郫縣豆瓣中分離篩選出得到兩株優勢菌，根據形態學和分子生物學的特性，鑒定為米曲霉，本研究采用真菌核糖體轉錄間隔區（ITS）的引物，進行PCR擴增，并將PCR產物進行ITS序列測序。測序結果與Genbank進行同源序列比對，結果顯示菌株ddQ-125和jcQ-93的序列與Genballk已知序列相似率可達99%以上。霉菌的序列分析結果與形態學鑒定基本一致。新分離的高酶活菌株將用于郫縣豆瓣復合菌制曲的研究。

[1]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[2]劉彩香.傳統醬種曲中霉菌的分離鑒定及培養條件的優化[D].武漢：湖北工業大學碩士論文，2011.

[3]解順昌,等.一株甲基對硫磷降解菌——米曲霉JMUPMD-2 的分離與鑒定[J].微生物學通報，JUL 20，2011，38（7）：1007-1013.

[4]魯 緋，等.一株丹貝中分離霉菌的鑒定[J].中國釀造，2010，29（6）：35-37.

[5]貢漢坤，姚海清.傳統醬類自然發酵的微生物學分析[J].中國調味品，2003（10）：9-12.

[6]陳 麗.傳統發酵豆醬制品菌群動態分析及功能菌的篩選[D].哈爾濱：黑龍江大學碩士論文，2009.

[7]李幼筠.“郫縣豆瓣”剖析[J].中國釀造，2008，27（11）：83-84.

[8]鄧 靜，徐 靜，吳華昌，等.米曲霉高產酸性蛋白酶菌株的選育[J].中國調味品，2010（1）：53.

[9]周其洋，陶文沂.米曲霉多酶系優良菌株的誘變選育[J].中國調味品，2009（9）：60.

[10]劉旭川，王 勇，羅 成，等.Viili 中霉菌的分離純化與鑒定[J].食品科學，2010，31（3）：208.

[11]SOMOGYI M.Modifications of two methods for the assay of amylase[J].Clin Chem,1960,6(1):23-35

[12]MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination reducing sugar[J].Anal Chem,1959,31(3):426-428.