劍門火腿菌相構成及主要腐敗菌特性分析

李欣蔚，遲原龍，賈冬英，黃 灝，姚 開*

（1.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.成都大學 師范學院，四川 成都 610106）

劍門火腿是以豬后腿為原料在自然或人工控溫條件下進行腌制和長時間發酵而成的具有特殊風味、色澤與質地的肉制品，是烹調美味佳肴的上乘原料，但其在貯藏過程中微生物會繼續生長繁殖，從而導致其腐敗變質。國內外對發酵肉制品中微生物的種群及其變化已進行了較多研究，李平蘭等[1]發現宣威火腿中的主要優勢菌是葡萄球菌、微球菌和霉菌，且表層數量明顯多于內部；甄宗園等[2]對金華火腿發酵過程中微生物區系的研究顯示，葡萄球菌和乳酸菌是火腿內部的優勢菌；PAARUPT等[3]研究認為，微球菌是西班牙干腌火腿中數量最多的微生物。基于原料、工藝和環境等不同因素會影響發酵火腿中微生物的組成和比例，加之目前有關劍門火腿的微生物特性研究尚無報道，因此對劍門火腿的菌相構成及其主要腐敗菌的特性進行了分析，其研究結果可為傳統發酵火腿的防腐保質提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

劍門火腿由四川劍閣某火腿廠提供；MSA培養基、MRS培養基、VRBDA培養基、孟加拉紅培養基為北京奧博星生物技術公司提供，生理生化鑒定所用培養基（氧化酶、接觸酶、葡萄糖發酵、蛋白酶、脂肪酶、耐酸、耐鹽、耐亞硝酸鹽、產粘、產酸、產氨、產氣、產H2S）的制備方法見參考文獻[4]；其他均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

儀器UV-2000型紫外可見分光光度計，PHS-2C型酸度計等。

1.3 方法

1.3.1 火腿的菌相分析

剔除火腿表面氧化層，分別隨機取火腿表層及其2.0cm以下的肌肉組織，取剪碎后混合的適量樣品，加入定量的無菌生理鹽水，勻漿后進行梯度稀釋。取適當稀釋度的菌懸液，分別接入不同選擇性培養基中于適宜條件下進行培養，其中MSA培養基、MRS培養基、VRBDA培養基于37℃培養48h，孟加拉紅培養基于28℃培養96h。對不同選擇性培養基中的典型菌落進行計數（平行重復3次，取其平均值）、分離純化、形態及生理生化特征檢測。

1.3.2 菌株耐鹽性測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于NaCl濃度為9.0%、12%、15%（w/v）的MSA和MRS液體培養基中，37℃培養24h，測其OD600值，以未接菌株的培養基作為空白對照。

1.3.3 菌株耐亞硝酸鹽性測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于含有150mg/kg NaNO2的MSA和MRS液體培養基中，37℃培養24h，測其OD600值，以未接菌株的培養基作為空白對照。

1.3.4 菌株耐酸性測定

將分離得到的葡萄球菌和微球菌分別接種于pH值為4.5的MSA液體培養基中，37℃培養24h，測其OD600值，以未接菌株的培養基作為空白對照。

1.3.5 菌株產粘能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS固體培養基，37℃培養24h，接種環挑取菌落判斷其粘性。

1.3.6 菌株產酸能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養基，37℃培養24h，測定其pH值，以未接菌株的培養基作為空白對照。

1.3.7 菌株產氨能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于產氨培養基中，37℃培養24h，滴加3～5滴氨試劑，觀察沉淀生成情況，產生黃色或棕紅色沉淀者為陽性，否則為陰性。

1.3.8 菌株產氣能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于葡萄糖發酵培養基中，37℃培養24h，杜氏小管內有氣泡產生者為陽性，否則為陰性。

1.3.9 菌株產H2S能力測定

將分離得到的細菌菌株分別穿刺接種于H2S培養基中，37℃培養2d，沿穿刺線產生黑色沉淀的為陽性，否則為陰性。

1.3.10 菌株蛋白酶活力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養基中，37℃培養24h。取0.1mL菌液涂布于酪蛋白培養基上，37℃培養5d，于菌落周圍滴加10%（v/v）三氯乙酸，觀察菌落周圍是否出現透明圈并測其直徑d（d<0.1cm為產酶能力弱，d：0.1cm～0.5cm為產酶能力中等，d>0.5cm為產酶能力強）。

1.3.11 菌株脂肪酶活力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養基中，37℃培養24h。取0.1mL菌液涂布于豬背脂培養基上，37℃培養5d，觀察菌落周圍是否出現透明圈并測其直徑d。

2 結果與分析

2.1 劍門火腿的菌相構成

分別對MSA和MRS培養基上的典型菌落進行分離和純化，依據BROWN MH等[5]推薦的肉品中微生物的鑒定程序對其進行生理生化檢測，并對孟加拉紅培養基上的典型菌株進行菌落形態和個體形態的觀察。結果顯示，由MSA培養基分離出3株葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）和1株微球菌（C-1），由MRS培養基分離出2株乳酸菌（L-1和L-2），由孟加拉紅培養基分離出2株霉菌（M-1和M-2）和2株酵母菌（Y-1和Y-2）。

劍門火腿表面和內部肌肉組織中的菌相構成如圖1所示。可以看出，火腿中微生物主要由葡萄球菌、微球菌和酵母菌構成，且表層數量明顯多于內部。火腿中霉菌主要分布于其表面，且數量較少（僅為70cfu/g），結果與宣威火腿中的霉菌數量相差較大[1]，這可能與火腿表面氧化層已剔除有關；火腿表層的細菌主要為葡萄球菌和微球菌，而內部主要由葡萄球菌和乳酸菌構成，該結果與李平蘭等[1]和甄宗圓[2]的研究結論相一致，這是由于火腿表面的高鹽環境抑制了某些乳酸菌的生長，而火腿內部致密的組織和無氧的環境不利于微球菌生長的緣故；酵母菌在劍門火腿中也占有一定的比例；劍門火腿中基本無腸桿菌檢出，這是由于火腿中的高鹽量（8.5%～9.0%）抑制了腸道菌的生長，或葡萄球菌和乳酸菌對腸桿菌具有一定的限制作用[3]。

圖1 劍門火腿的菌相構成Fig.1 Microflora composition in Jianmen ham

2.2 劍門火腿中菌株的耐鹽性

劍門火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌于不同NaCl濃度下的生長量見表1。可以看出，菌株的生長量隨NaCl濃度的增加而降低；3種菌在9.0%NaCl下均有一定生長，但在17%NaCl下僅有葡萄球菌S-1和微球菌C-1生長，且菌株C-1的OD600值僅為0.026，表明其生長很弱。由于劍門火腿的含鹽量為8.5%～9.0%，故在此條件下3種菌都能正常生長，其中葡萄球菌S-1的耐鹽能力最強。

表1 不同NaCl 濃度時菌株的吸光值Table 1 OD600of strains in different concentrations of NaCl

2.3 劍門火腿中菌株的耐亞硝酸鹽能力

劍門火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌在NaNO2濃度為150mg/kg下的生長量見表2。可以看出，6株菌均具有一定的亞硝酸鹽耐受性，其中葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）對亞硝酸鹽具有較強的耐受性，而微球菌C-1和乳酸菌（L-1和L-2）對亞硝酸鹽的耐受性相對較弱。

表2 含亞硝酸鹽培養液中菌株的吸光值Table 2 OD600of strains in nitrite-containing media

2.4 劍門火腿中菌株的耐酸能力

劍門火腿中葡萄球菌及微球菌于pH值為4.5培養液中的生長量見表3。可以看出，葡萄球菌均具有一定的耐酸性，其中菌株S-1的耐酸性最強；微球菌C-1的耐酸性較差。

表3 pH4.5 培養液中菌株的吸光值Table 3 OD600of strains in pH 4.5 media

2.5 劍門火腿中菌株的致腐特性

劍門火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌的致腐特性見表4。可以看出，葡萄球菌和微球菌均不產粘、不產氨、不產氣、不產H2S，且產酸能力較弱；葡萄球菌S-3可產蛋白酶，而菌株S-1和S-2及C-1均不產生蛋白酶；葡萄球菌和微球菌都具有產脂肪酶的能力，其中菌株S-2和S-3及C-1具有中等的產脂肪酶能力，這與劉曉強[4]對云南火腿中葡萄球菌和微球菌的主要特性分析結果基本相同。

表4 劍門火腿中主要細菌的致腐特性Table 4 Spoilage capabilities of main bacteria in Jianmen ham

乳酸菌L-1不產粘，而菌株L-2具有產粘特性；菌株L-1和L-2均不產氨、不產氣、不產H2S，但產酸能力均較強；菌株L-2具有一定的產蛋白酶能力；2株乳酸菌均具有一定產脂肪酶能力，其中菌株L-2的產脂肪酶能力更強。微生物產粘可能是其分解蛋白質的緣故，不僅破壞肉品的內部組織，而且影響產品外觀，進而造成其腐敗變質；而脂肪在微生物產生的脂肪酶作用下發生水解，也會加速肉品的酸敗變質。此外，乳酸菌在同型發酵過程中產生的有機酸降低了環境的pH值，使肉品發生腐敗而產生酸味[6]。

綜上所述，可以認為劍門火腿中的葡萄球菌S-3及乳酸菌L-2是導致其腐敗的主要微生物。

3 結論

劍門火腿的菌相是由種類不同的微生物所構成。其中，葡萄球菌、微球菌和酵母菌的數量占優，且表層數量明顯高于其肌肉組織內部；乳酸菌主要分布于火腿內部，霉菌主要存在于火腿表層。主要細菌的致腐特性分析結果顯示，葡萄球菌S-3和乳酸菌L-2是導致劍門火腿腐敗的主要菌株。

[1]李平蘭，沈清武，呂燕妮，等.宣威火腿成熟產品中主要微生物菌相構成分析[J].中國微生態學雜志，2003，15（5）：262-263.

[2]甄宗圓.金華火腿微生物區系研究[D].重慶：西南農業大學碩士學位論文，2004.

[3]PAARUP T,NIETO JC,PELAEZ C,et al.Microbiological and physico-chemical characterization of deep spoilage in Spanish dry-cured hams and characterization of isolatedEnterobacteriaceaewith regard to salt and temperature tolerance[J].Eur Food Res Technol，1999，209（5）：366-371.

[4]劉曉強.云南火腿中菌種的分離篩選及在發酵火腿中的應用[D].長春：吉林農業大學碩士學位論文，2008.

[5]BROWNMH.Meat Microbiology[M].New York:Applied Science Publishers LTD，1982：474-475.

[6]張春江，王海燕，羅 欣.微生物引起的肉與肉制品的腐敗[J].微生物與食品，2001（6）：16-19.