貓棒束孢真菌液體發酵工藝研究

楊喜花，張生萬 *，任連生

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學化學化工學院，山西 太原 030006；3.山西省腫瘤研究所比較醫學部，山西 太原 030013）

貓棒束孢（Isaria felina）是從天然冬蟲夏草子實體中經菌種分離后培養得到的一株真菌，經中國科學院微生物研究所郭英蘭教授鑒定為Isaria felina（DC.：Fr.）Fr.，在分類上屬于半知菌綱、叢梗孢目、棒束孢屬。該菌種已被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（保藏號：CGMCCNO.0706），是一種新的冬蟲夏草菌種。國內外目前關于貓棒束孢的研究報道較少。郭永霞從貓棒束孢菌絲體中分離純化得到具有抗真菌作用的環縮肽isarfelin，并對isarfelin進行了理化性質的分析、結構鑒定，并發現isarfelin具有抑制細菌、抵抗真菌的活性[1]。BAUTER、Deffieux G等從貓棒束孢中提取分離得到環羧酚酸肽結構的具有殺蟲作用的成分Isariins B，C和D，并對Isariins B，C和D的結構進行了鑒定[2-3]。IKUMOTOT等研究發現Isaria felina的浸出液對離體心房有負收縮效應，同時對電刺激回腸的收縮反應及人血小板的凝結有抑制作用[4]。天然冬蟲夏草是我國傳統的名貴中草藥，具有保肺益腎等補益功能[5-6]，對腎臟組織有一定的保護和修復作用，臨床上多用于慢性腎病的治療[7]，由于天然冬蟲夏草價格昂貴，現一般多用從天然冬蟲夏草中分離得到的菌種經人工培養獲得的菌絲體代替，如百令膠囊、金水寶膠囊等[8]。而我們前期研究結果表明，貓棒束孢對腺嘌呤誘導的慢性腎衰及甘油誘導的急性腎衰均有很好的治療作用，因此貓棒束孢具有遠大的開發應用前景，有希望開發為腎病治療藥物。本文就貓棒束孢的液體發酵工藝進行優化實驗研究，從而可以增加貓棒束孢的產量，為工業化生產貓棒束孢提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

貓棒束孢菌種，于山西省腫瘤研究所比較醫學部保藏。

1.2 試劑

蛋白胨，酵母膏，酵母粉，蔗糖，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉。

1.3 主要儀器

HZ-9310K型全溫振蕩器：太倉市科技器材廠；光學顯微鏡：日本Olympus CX21FS1；筆式pH計：上海虹益器材儀表有限公司；生物安全柜：青島海爾醫用低溫科技有限公司；低速冷凍離心機：科大創新股份有限公司KDC-2044；876-1型真空干燥箱：上海新諾儀器廠。

1.4 實驗方法

將一定體積的培養基裝于3000mL三角瓶中，牛皮紙封口，125℃高壓滅菌40min，冷卻至室溫，接入菌種，置于180r/min搖床上，于一定溫度條件下旋轉發酵培養，收集發酵液，將發酵液于2000r/min離心5min，得菌絲體及上清液，分別于80℃烘24h，測干重。

2 結果

2.1 培養基的選擇

將貓棒束孢菌種分別接種于培養基1（蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，飽和碳酸氫鈉溶液調節pH值為6.5～7.0）和培養基2（蛋白胨0.6%，酵母粉1.2%，蔗糖2.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，飽和碳酸氫鈉溶液調節pH值為6.5～7.0）中，于26.5℃進行發酵培養48h，分別收集菌絲體及上清液，于80℃烘干24h，測干重。結果見表1。

表1 培養基篩選結果Table 1 Result of screening medium

由表1可見，使用培養基1進行發酵培養貓棒束孢，其菌絲體及上清液得率均優于培養基2，這與酵母膏與酵母粉的成分不同有關。酵母粉沒有經過分解，是酵母液體純培養干燥后的一種性狀，可以做為蛋白原料理解；而酵母膏的營養物質得到過分解，是酵母破壁以后除去酵母細胞壁以后的細胞內容物質，主要成分是氨基酸、肽、核甘酸、B族維生素等，再復配微量元素、P源等營養元物質而成，可按照微生物培養基的概念去理解。

2.2 培養基裝量的選擇

將貓棒束孢菌種接種于培養基1裝量分別為1000mL、800mL、500mL、300mL的3000mL的三角瓶中，于26.5℃進行發酵培養48h，分別收集菌絲體及上清液，于80℃烘干24h，測干重。結果見表2。

表2 裝量篩選結果Table 2 Effect of culture medium volume on Isaria felina production

由表2可見，培養基裝量在500mL以上時，菌絲體及上清液的收率隨著裝量的增加反而降低，而培養基裝量在500mL以下時，菌絲體及上清液的收率卻隨著裝量的增加而增加。培養基裝量為500mL時，菌絲體得率及上清液收率均最高，故采用500mL裝量。

2.3 溫度對工藝的影響

將貓棒束孢菌種接種于培養基1裝量為500mL的300mL三角瓶中，分別于30℃、26.5℃、22℃下進行發酵培養48h，分別收集菌絲體及上清液，于80℃烘24h，測干重。結果見表3。

表3 溫度篩選結果Table 3 Effect of culture temperature on Isaria felina production

由表3可見，在30℃和22℃時菌絲體生長較慢，甚至不生長，而在26.5℃時生長較佳，說明菌絲體的生長對環境要求較為嚴格，在高溫和低溫環境中不易生長。

2.4 發酵時間對工藝的影響

將貓棒束孢菌種接種于培養基1裝量為500mL的3000mL三角瓶中，分別于26.5℃下發酵培養36h、48h、60h，收集菌絲體及上清液，于80℃烘24h，測干重。結果見表4。

表4 發酵時間篩選結果Table 4 Effect of culture time on Isaria felina production

由表4可見，發酵時間48h時，貓棒束孢菌絲體及上清液產率均較高，而發酵時為36h和60h時，貓棒束孢菌絲體及上清液產率均有所降低。

3 結論

經過對培養基、培養基裝量、溫度、發酵時間等因素的考察，我們確定了貓棒束孢最佳發酵工藝：培養基為蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，飽和碳酸氫鈉溶液調整pH值為6.5～7.0；培養基裝量為500mL，發酵溫度為26.5℃，發酵時間為48h。

[1]GUOYX,LIU QH,NGTB,et al.Isarfelin,a peptide with antifungal and insecticidal activitiesfromIsariafelina[J].Peptides，2005，26（12）：2384-2391.

[2]BAUTER,DEFFIEUX G,MERLET D,et al.New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungusIsaria felina.I.Production,isolation and insecticidal propertiesof isariins B,Cand D[J].J Antibiot，1981，34（10）：1261-1265.

[3]DEFFIEUX G,MERLET D,BAUTER,et al.New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungus Isaria felina.II.Structure elucidation of isariins B,Cand D[J].J Antibiot，1981，34（10）：1266-1270.

[4]IKUMOTOT,SASAKIS,NAMBA H,et al.Physiologically activecompounds in the extracts from Tochukaso and cultured mycelia ofCordycepsandIsaria[J].Yakugaku Zasshi，1991，111（9）：504-509.

[5]WANG Y,YIN H,LV X,et al.Protection of chronic renal failure by a polysaccharide fromCordyceps sinensis[J].Fitoterapia，2010，81（5）：397-402.

[6]許惠娟，李時悅，林云恩，等.人工冬蟲夏草聯合糖皮質激素對大鼠肺纖維化的干預作用[J].中國中藥雜志，2011，36（16）：2265-2270.

[7]LIY,XUE WJ,TIAN PX,et al.Clinical application ofCordyceps sinensison immunosuppressive therapy in renal transplantation[J].Transplant Proc，2009，41（5）：1565-1569.

[8]陳孝文，梁 東，劉華鋒.慢性腎功能衰竭[M].第一版.北京：中國醫藥科技出版社，2006：280.