高效液相色譜串聯質譜法測定醬油中水解氨基酸

陳 媛 ，吳惠勤*，杭義萍，黃曉蘭，黃 芳，朱志鑫，林曉珊，羅輝泰

（1.華南理工大學 化學與化工學院，廣東 廣州 510640；2.中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070）

釀造醬油是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經微生物發酵釀制成的具有特殊色、香、味的液體調味液[1]。目前市場上出現了配制醬油和水解植物蛋白液[2]冒充釀造醬油的現象，為了鑒別釀造醬油與水解醬油，有人對醬油的香氣成分、游離氨基酸以及水解醬油中的有害物質進行了研究[3-14]。但是針對醬油中的多肽的水解氨基酸的研究未見報道。醬油發酵過程中所產生的一系列極其復雜的化學反應，與微生物和生物化學有著密切的關系。其中，原料中的蛋白質在蛋白酶的作用下，水解生成胨、肽及氨基酸。但蛋白酶不能將所有的蛋白質都酶解為氨基酸，釀造醬油中還保留大量的中間產物——肽類等物質。而酸水解植物蛋白液是以含有食用植物蛋白的脫脂大豆等原料經鹽酸水解，堿中和制成的液體調味液，制作過程一般原料用6mol/L鹽酸在110℃條件下水解22h而成，水解反應過程劇烈，其中間產物——肽類的含量與釀造醬油不同。本研究旨在找出二者中間產物肽類的水解氨基酸含量和組成上的差異，為鑒別釀造醬油與水解醬油提供依據。現有文獻報道的只有使用高效液相色譜或氨基酸自動分析儀檢測醬油中的游離氨基酸，目前還沒有人做過使用HPLCMS/MS檢測醬油中肽類的氨基酸組成的研究。而HPLCMS/MS的優勢在于采用“母離子>子離子”的多反應檢測模式（MRM），大大提高檢測的靈敏度和選擇性，而且可針對不同化合物同時選擇多對不同的檢測離子，實現多組分同時檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然發酵醬油原油（不含任何添加劑），酸水解植物蛋白液：廣東珠江橋生物科技股份有限公司提供。氨基酸對照品谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸：購自Sigma公司；鹽酸、正丁醇、甲醇、乙醇（分析純）：廣州化學試劑廠；乙腈（色譜純）：德國Merck公司；實驗室用水為雙蒸水。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200LC/6410B MS液相色譜/串聯四極桿質譜聯用儀，由二元梯度泵、自動進樣器，柱溫箱，Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱組成；勝譜實驗電熱板；DHG-9041A型電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；XW-80A旋渦混合器：江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；TDZ5-WS平衡離心機：湖南賽特湘儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理方法

多肽物質提取及水解：分別取5mL樣品水浴80℃條件下蒸干，加入10mL 70%vol乙醇超聲，振蕩，4000r/min離心5min，倒掉上清液，沉淀加入5mL70%vol乙醇重復洗滌一次，倒掉上清液，沉淀用氮氣揮干乙醇，用16mL 6mol/L鹽酸溶解，裝入20mL的頂空進樣瓶，抽真空充氮氣，加入3滴重蒸苯酚。110℃于恒溫干燥箱中水解22h。水解后樣品過濾到燒杯中，電熱板80℃蒸干鹽酸，加5mL雙蒸水，取1mL定容至50mL。

水解氨基酸衍生化：水解得到的溶液100μL于2mL進樣瓶中，80℃氮氣水浴吹干，加入50μL 2.5mol/L鹽酸正丁醇，壓蓋，渦旋混勻，80℃衍生40min，取出后氮氣吹干，加1mL80%乙腈水溶液渦旋1min，過0.20μm有機濾膜，HPLC-MS/MS測定[15]。

1.3.2 分析條件

色譜條件：Thermo BDSHYPERSILC18色譜柱（150mm×2.1mm，2.4μm），流動相A為10mmol/L甲酸銨（含0.2%甲酸），B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5min，0%～40%B；5.1min～7min，40%～80%B；7min～8min，80%～0%B；8min～12min，0%～0%。流速0.2mL/min；進樣量：1μL；柱溫：30℃。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式，干燥氣（N2）溫度為350℃，霧化氣（N2）壓力為275.8kPa，干燥氣（N2）流量10.0L/min，電噴霧電壓4000V，掃描方式為多反應監測（MRM）模式，質譜分析參數見表1。

表1 氨基酸的質譜分析參數Table 1 HPLC-MS-MS parameters of amino acid

1.3.3 標準溶液配制

準確稱量氨基酸對照品用0.1mol/L鹽酸溶解配制成含每種氨基酸200mg/L（其中谷氨酸和天冬氨酸濃度為400mg/L），再稀釋成1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L系列濃度，按1.3.1衍生化方法進行衍生，上機。

1.4 計算公式

標準曲線法計算水解氨基酸含量：

2 結果與討論

2.1 沉淀多肽的溶劑及其濃度的選擇

試驗了30%vol、50%vol、70%vol、90%vol乙醇和70%vol甲醇作沉淀劑沉淀多肽的效果，其總離子流圖見圖1，由圖1看出，70%vol乙醇沉淀出的多肽的水解氨基酸峰高最高，證明70%vol乙醇沉淀出的多肽最多，實驗效果最好。沉淀后的多肽在水解前用5mL70%vol乙醇溶解，按1.3.1的方法相同條件下進行衍生，得到釀造醬油和水解醬油空白樣。其與多肽水解氨基酸的總離子流圖見圖2，結果證明，70%vol乙醇基本能把除多肽以外的游離氨基酸洗掉，沒有游離氨基酸的干擾，得到的沉淀物是不溶于70%vol乙醇的多肽，其水解后得到的氨基酸完全是組成多肽的氨基酸。

圖1 30%vol，50%vol，70%vol，90%vol乙醇與70%vol甲醇作沉淀劑峰面積圖Fig.1 Peak area of 30%vol，50%vol，70%vol，90%vol ethanol and 70%vol methanol precipitate

2.2 方法的精密度，線性范圍，檢出限和定量限

按1.3.3方法測定得氨基酸對照品的峰面積，以峰面積為Y值，氨基酸質量濃度為X值對數據進行線性回歸，結果表明在0.001mg/L～1.0mg/L濃度范圍內，16種氨基酸的峰面積和濃度呈良好的線性關系，相關系數R2為0.998以上。精密取6份天然發酵醬油原油，按1.3.1樣品衍生方法處理上機，測定方法的精密度，結果表明，各氨基酸的RSD在1.05%～8.88%范圍內。16種氨基酸的相對標準偏差，回歸方程，按3倍信噪比計算方法的檢出限和按10倍信噪比計算方法的定量限（S/N=10）見表2。

2.3 多肽的水解氨基酸的含量及相對百分含量

圖2 70%vol乙醇沉淀水解油后的空白樣(a)，沉淀天然釀造醬油原油的空白樣(b)，FSS(c)和HVP(d)的多肽水解氨基酸總離子流圖Fig.2 TIC of 70%vol ethanol blank sample of HVP (a) and FSS (b),FSS (c) and HVP (d) hydrolyzed amino acids in peptide

表2 16 種氨基酸的相對標準偏差，回歸方程，檢出限和定量限Table 2 The relative standard deviation of 16 kinds of amino acids,the regression equations,limit of detection and limit of quantitation

由天然釀造醬油原油和酸水解植物蛋白液的多肽的液相色譜-質譜總離子流圖，選擇MRM模式，提取16種氨基酸的檢測離子，各色譜峰經質譜母離子、子離子，相對保留時間定性，氨基酸對照品定量，分別得到16種水解氨基酸的含量，計算其相對百分含量，結果見表3。

表3 天然發酵醬油原油和水解植物蛋白液水解氨基酸含量及其相對百分含量Table 3 Hydrolyzed amino acids content and the relative content of FSS and HVP

由表3可以看出，天然發酵醬油原油中組成多肽的水解氨基酸總量約是酸水解植物蛋白液的10倍，FSS中多肽的總量為2378.76mg/L，HVP中多肽的總量為247.57mg/L。其中FSS中組成多肽必需氨基酸的總量是700.68mg/L，占總氨基酸的29.46%。HVP組成多肽的必需氨基酸的總量是60.33mg/L，占總氨基酸的24.37%。說明天然發酵醬油原油的營養價值遠遠高于酸水解植物蛋白液。從組成多肽的水解氨基酸的總量可以區分天然釀造醬油和酸水解植物蛋白液。

對各種水解氨基酸的質量濃度進行比較，FSS中排名前五位的水解氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸、亮/異亮氨酸、賴氨酸、絲氨酸，其質量濃度分別為462.29mg/L、437.63mg/L、245.99mg/L、158.50mg/L、157.16mg/L。HVP中排名前5位的水解氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸、亮/異亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸，其質量濃度分別為62.08mg/L、35.12mg/L、24.93mg/L、22.94mg/L、19.66mg/L。從組成多肽的水解氨基酸的含量可知，FSS和HVP的水解氨基酸含量差異較大，其中谷氨酸和天冬氨酸所占比例最多，這與原料中組成蛋白質的氨基酸比例有很大關系，有研究表明，大豆蛋白質中谷氨酸和天冬氨酸含量最多，蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸含量很少[16-17]，另外色氨酸在酸水解條件下會和含醛基的化合物（如糖）作用生成黑色物質而被破壞掉，蛋氨酸、半胱氨酸含有硫原子，水解的過程也很容易被氧化掉，所以FSS和HVP的水解氨基酸中都未檢測到蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸。醬油中的肽多為酸性肽，醬油中的多肽顯味性遠遠低于游離氨基酸，但是肽能增強醬油味道的厚度和延長味的持續性，在烘托游離氨基酸的鮮味、甜味、苦味表現上十分重要。亮氨酸和異亮氨酸是同分異構體，相對分子質量相同，都是131.2g/moL，與正丁醇酯化后加上一個酯基，分子量增加57，所以其檢測離子對都是188>86，又因為其極性相同，在本文色譜條件下同時出峰，實際檢測到的是2種氨基酸的含量，所以其質量濃度比較大，在FSS和HVP中都排在第三位。賴氨酸是人體的第一必需氨基酸，在人體新陳代謝過程中發揮著重要的作用，由于谷物食品中的賴氨酸含量甚低，且在加工過程中易被破壞而缺乏，故稱為第一限制性氨基酸。天然發酵醬油原油中賴氨酸在多肽中的含量21倍高于酸水解植物蛋白液，其中FSS中賴氨酸的含量為158.50mg/L，HVP中賴氨酸的含量為7.56mg/L。所以可以從組成醬油多肽的賴氨酸的含量分析區分天然釀造醬油和酸水解植物蛋白液。

FSS多肽中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸相對百分含量約是HVP的2倍。FSS多肽中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸相對百分含量分別是6.66%、2.24%、3.02%，而HVP多肽中這3種氨基酸相對百分含量分別是3.05%、1.18%、1.12%。HVP中丙氨酸、脯氨酸相對百分含量約是FSS的2倍。HVP多肽中丙氨酸、脯氨酸相對百分含量分別是9.26%、7.94%，FSS多肽中這2種氨基酸相對百分含量分別是5.76%、4.56%。以上表明FSS和HVP中個別氨基酸的相對百分含量存在數量上的倍數關系，鑒于此可以從單個水解氨基酸的相對百分含量鑒別天然釀造醬油和酸水解植物蛋白液。

3 結論

本實驗通過使用HPLC-MS/MS方法分別對天然發酵醬油原油和酸水解植物蛋白液中的多肽的水解氨基酸的含量和比例進行了研究，除蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸未檢出外其他16種氨基酸均得到很好的檢出。實驗結果表明FSS中的多肽總量約為HVP的10倍，其中多為酸性肽，谷氨酸和天冬氨酸的占比接近40%。FSS中的賴氨酸、組氨酸、酪氨酸相對百分含量是HVP的2倍。其中FSS中賴氨酸的含量為158.5mg/L，是HVP的21倍，所以賴氨酸可以作為一種特征氨基酸判定是否為水解植物蛋白液。本研究也為質檢系統對醬油的檢測提供新的思路。

[1]GB/T 18186-2000，釀造醬油[S].

[2]SB/T 10338-2000，酸水解植物蛋白調味液[S].

[3]朱志鑫，吳惠勤，黃曉蘭.醬油香氣成分GC/MS分析[J].食品研究與開發，2007，28（12）：135-138.

[4]黃 毅，鎖 然，李 娜.醬油中氨基酸的組成與分析[J].中國調味品，2012，37（3）：101-107.

[5]范 琳，蔣立文，陶湘林，李先淼.2種不同工藝醬油原油的揮發性成分的分析[J].中國釀造，2012，31（1）：178-183.

[6]邱丹丹，王 超，于春煥，等.釀造醬油與配制醬油鑒別方法研究進展[J].中國釀造，2010，29（7）：7-9.

[7]黃 毅，鎖 然，李 娜.主成份分析在醬油質量評價中的運用[J].食品工業科技，2011，33（11）：324-329.

[8]馮月超，等.同時測定飲料中20種游離氨基酸含量[J].食品科技，2011，36（4）：262-265.

[9]宗雯雯，冷云偉，葛冬梅，等.幾種醬油中氨基酸組分分析與比較[J].食品與機械，2008，24（4）：106-107.

[10]熊芳媛，蔡明招，吳慧勤.醬油香氣成分的研究——頭油和生抽香氣成分的比較[J].中國釀造，2008，27（9）：51-55.

[11]葛冬梅，宗雯雯，朱笑梅，等.醬油中游離氨基酸成分分析[J].中國釀造，2008，27（13）：75-77.

[12]SANO A,SATOH T,OGUMA T,et al.Determination of levulinic acid in soy sauce by liquid chromatography with mass spectrometric detection[J].Food Chem，2007，105（3）：1242-1247.

[13]FANGQ,HANNA MA.Experimental studiesfor levulinic acid production from whole kernel grain sorghum[J].Bioresource Technol，2002，81（3）：187-192.

[14]鄭家概.醬油中氨基酸特征圖譜分析研究及生產工藝鑒定[D].廣州：華南理工大學碩士論文，2010.

[15]李 慧，林哲絢，張 源，等.高效液相色譜-質譜-質譜法測定腦組織中氨基酸類神經遞質[J].分析測試學報，2005，24（2）：89-91.

[16]宋 剛.論釀造調味品的新技術及其發展方向[J].中國釀造，2003，22（2）：1-5.

[17]袁 圓，魯 緋，黃持都，等.醬油功能性研究最新進展[J].中國釀造，2010，29（1）：1-4.