銀合歡種子多糖提取工藝優化

郭守軍，楊永利，李浩龍，葉文斌，黃錦霞

（1.韓山師范學院 生物系，廣東 潮州 521041；2.隴南師范高等專科學校，甘肅 成縣 742500）

銀合歡[Leucaena leucocephala（Lam.）de Wit]是豆科含羞草亞科銀合歡屬多年生灌木，主要特性是抗逆、速生、高產、優質及其適應性強[1]。原產熱帶美洲，現廣布于熱帶地區，中國臺灣、福建、廣東、海南、香港、廣西、湖南、貴州、四川（西南部）和云南等地有栽培。銀合歡種子多糖主要成分是半乳甘露聚糖，是植物的儲備性多糖，主要存在于豆科植物種子的胚乳中，具有較強的吸水和保水能力，可作為增稠劑、凝膠劑、穩定劑和凝聚劑等廣泛應用于食品、醫藥等許多工業領域[2-4]。近年來的研究表明，半乳甘露聚糖膠具有抗凝、纖維蛋白溶解、免疫調節、抗潰瘍、抗病毒、降血糖、降膽固醇和減肥等作用[5-6]。所以半乳甘露聚糖型植物多糖的研究近年來倍受眾多國外學者與制藥廠商的關注。銀合歡種子多糖的流變性研究表明，銀合歡種子多糖具有良好的耐鹽穩定性，在酸和堿性條件下也具有良好的穩定性，故銀合歡種子多糖可添加在醬油、醋等高鹽食品和酸性堿性食品中[7]。

本研究通過單因素和L9（33）正交試驗對熱水浸提法提取銀合歡種子多糖的提取工藝進行優化，為銀合歡種子多糖的進一步開發研究和利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1.1 主要材料和試劑

銀合歡種子購于云南省林木種苗站，葡萄糖（純度＞99.99%）購于Sigma公司；苯酚、濃硫酸、95%vol乙醇均為分析純。

1.1.2 主要儀器

SL320N電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司生產），TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機（上海安亭科學儀器廠），RE-52D旋轉蒸發器（上海青浦滬西儀器廠），HJ-6A六聯恒溫磁力攪拌器（金壇市宏華儀器廠），LGJ-18型冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠），9101微型高速樣品粉碎機（北京檢測儀器有限公司）；UV-2800型紫外可見光分光光度計（尤尼卡上海儀器有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀合歡種子多糖的提取流程

銀合歡種子在50℃烘干后將其粉碎，稱取10g用無水乙醇回流脫脂，再在50℃時干燥，然后加入一定量的水，在一定溫度條件下進行一定時間的提取，提取液經過減壓濃縮得濃縮液，加乙醇醇析得粗多糖沉淀，抽濾，沉淀分別用甲醇、丙酮依次洗滌，冷凍干燥后得多糖產品。

1.2.2 銀合歡種子多糖含量的測定方法

本實驗采用苯酚—硫酸法測定總的多糖含量[8]。

1.2.3 單因素試驗

料液比采用1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 7個水平，浸提溫度采用40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃6個水平，浸提時間采用1h、2h、3h、4h、5h、6h，乙醇濃度為70%vol、75%vol、80%vol、85%vol、90%vol、95%vol 6個水平分別進行單因素試驗。

1.2.4 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，選定3因素3水平L9（33）作正交試驗，確定提取銀合歡種子中可溶性多糖的最佳提取工藝參數，用苯酚—硫酸法測定多糖含量，統計實驗結果。

1.2.5 核酸、蛋白質的檢測[8-9]

多糖水溶液在波長200nm～400nm處掃描，在260nm及280nm處檢測有無吸收峰，茚三酮法顏色檢測。

1.2.6 統計分析

試驗結果用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，進行方差分析和SSR顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 多糖含量的測定[10-11]

在試驗條件下，以標準液濃度（mg/mL）為橫坐標，為吸光度值為縱坐標，得標準曲線，見圖1，計算回歸方程：y=5.1086x+0.0061，相關系數R2=0.9999。多糖提取率=V×C×f×W2/（W3×W1）×100%。W1：稱取干銀合歡種子粉末的質量（g）；W2：由W1提取的粗多糖的質量（g）；W3：從W2中稱取的用于分析測定的粗多糖質量（g）；V：溶解W3定容后的體積（L）；f：多糖的校正系數[16]，f≈0.9；C：由回歸方程計算所得多糖的濃度（g/L）。

2.2 影響銀合歡種子多糖提取率的單因素試驗

2.2.1 料液比對銀合歡種子多糖提取率的影響

料液比影響著物料的溶解度，當料液比偏低時，物料得不到充分的浸泡，多糖在提取溶劑中容易飽和，導致提取不充分；料液比偏高時，雖然提取可能較為充分，但是過高料液比的會造成濃縮時能耗的增加和醇沉時乙醇的大量浪費。料液比單因素試驗見圖2，隨著料液比的升高銀合歡種子多糖的溶出量呈逐漸升高的趨勢，多糖的得率也在增加，在料液比為1:35時，多糖的提取得率達到最大，為8.635%。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

圖2 料液比對銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharide

2.2.2 溫度對銀合歡種子多糖提取率的影響

話音未落，將軍右掌一拍幾案，身形暴起。幾案上的棋子受那一掌之力，立即飛起，未及落地，將軍右手五指連彈，把飛起的棋子盡數彈出。

固定提取料液比為1:35、時間為1h、95%vol乙醇進行醇沉（3倍于提取液總體積），考察不同溫度對多糖提取率的影響，見圖3，隨著提取溫度的升高，多糖得率逐漸升高，升高至60℃時，多糖得率達到最大，之后逐漸下降。

圖3 溫度對銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharide

2.2.3 時間對銀合歡種子多糖提取率的影響

處理時間對多糖的提取率的影響見圖4，在相同的最佳料液比和最佳溫度條件下，隨著熱浸提時間的增加，銀合歡種子中多糖提取率也在逐漸增加，浸提4.0h時多糖得率最高，之后稍有下降。

圖4 時間對銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.4 Effect of time on extraction yield of polysaccharide

2.2.4 乙醇濃度對銀合歡種子多糖提取率的影響

乙醇（3倍于提取液體積）濃度對多糖的提取率的影響見圖5，隨著醇沉濃度的增加，銀合歡種子多糖提取率緩慢增加，但在95%vol的醇沉濃度下多糖提取率為最高，所以選取95%vol的乙醇為最優醇沉濃度。

圖5 乙醇濃度對銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.5 Effect of alcohol concentration on extraction yield of polysaccharide

2.3 銀合歡種子多糖提取率的正交試驗

2.3.1 正交試驗設計和結果的直觀分析

在上述單因素試驗的基礎上，選定3因素3水平作正交試驗，因素水平、試驗結果計算及分析見表1。

從表1可知，根據正交試驗結果，比較各因素的極差結果R值，可以得知RC>RA>RB，說明提取時間是影響多糖提取率的最關鍵因素，其次是料液比，再次是提取溫度，主次順序為C>A>B。得出最優組合工藝為A2B2C3，即熱水浸提料液比為1:35，溫度為60℃，時間為5.0h，醇沉濃度為95%vol，多糖平均得率為12.155%。

2.3.2 正交試驗的方差分析

正交試驗的方差分析結果（表2）顯示，時間因素對銀合歡種子多糖提取率影響差異極顯著，對銀合歡種子多糖提取率的影響起最主要作用，溫度和料液比在此試驗范圍內對銀合歡種子多糖提取率影響差異顯著，對銀合歡種子多糖提取率的影響起次要作用，溫度對測定結果的影響較小。這與直觀分析結果是相一致的。

表1 銀合歡種子多糖提取正交試驗結果與分析Table 1 Result and analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction

表2 正交試驗結果的方差分析Table 2 ANOVA of orthogonal test result for polysaccharide extraction

2.3.3 正交試驗多重性比較

表3的SSR檢驗顯示，3個水平間都沒有顯著差異，故選平均值最大的，即料液比的最佳工藝參數是1:35。

表3 提取料液比各水平間差異顯著性SSR 檢驗Table 3 SSR differences significance of extract liquid ratio with various levels

表4的SSR檢驗顯示，控制提取溫度非常重要，3個水平都沒有顯著差異，故選平均值最大的，即溫度的最佳工藝參數是60℃。

表4 提取溫度各水平間差異顯著性SSR 檢驗Table 4 SSR differences significance of temperature with various levels

表5的SSR檢驗顯示，控制提取時間非常重要，3與1水平間有顯著差異，故時間最佳工藝參數為5h。

表5 時間各水平間差異顯著性SSR 檢驗Table 5 SSR differences significance of time with various levels

表6的SSR檢驗顯示，控制乙醇濃度非常重要，3和2與1相比均有極顯著差異，故應選擇乙醇最佳工藝的濃度為95%vol。

表6 乙醇各水平間差異顯著性SSR 檢驗Table 6 SSR differences significance of ethanol with various levels

2.4 有關提取流程的其他討論

因為是最佳優化工藝，所以樣品粉碎后不易過篩，在試驗過程中發現，經過篩后的殘渣中大部分為種皮，而種皮內表面附著胚乳，胚乳中含有大部分的多糖，所以在這樣條件下就能溶出胚乳中更多的多糖而不會浪費材料，如此可提高粗多糖的提取率，所以樣品粉碎后不必過篩。再則多糖的醇析采用3倍量的95%vol乙醇，4℃靜置1h，沉淀比較完全。試驗結束后采用菲林試劑進行脫色，冷凍干燥后得到的多糖為白色粉末，質量高于不除雜脫色工藝提取的多糖。

3 結論

3.1 銀合歡種子可溶性多糖不含蛋白、核酸。由于半乳甘露聚糖遇水溶脹，能產生很高的黏度，所以在多糖分散在水中之前，需要充分的溶脹。實際生產操作中，可以預先對種子在常溫下用水進行浸泡，讓胚乳中多糖充分溶脹后再進行加溫提取，可大大縮短提取時間，降低能耗。

3.2 在應用中應注意，銀合歡種子膠在冷水中的溶解度較低，約為50%，隨著溫度的升高，溶解度逐漸增加，并且加熱時間對其黏度影響較小，故可應用于高溫加熱和較長時間加熱的食品中。銀合歡種子膠溶液pH值為6.15，pH 3～11的范圍內。其黏度變化較小，可應用于陳醋等酸性食品及堿性食品加工中。鹽離子（Na+）濃度（5%和11%的NaCl溶液）對銀合歡種子膠溶液黏度的影響較小。加入食鹽后，膠溶液體系稍有波動，48h后溶液的黏度保持穩定。因此，銀合歡種子膠可以添加在番茄醬、甜面醬、午餐肉、蠔油和醬油等高鹽食品中[7]。

我國食用膠的年需求量為30000t～40000t，目前，我國自產食用膠量約為10000t左右，食用膠的缺口很大，只能靠進口，因此，研發新型食用膠是當務之急。銀合歡種子含有較多的水溶性多糖——半乳甘露聚糖，具有較好的增稠、穩定、凝膠作用。而銀合歡又為多年生灌木，分布廣泛，其種子資源較為豐富，為半乳甘露聚糖膠生產的良好原料之一[10-12]。

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