生物制麥中白地霉的篩選及其特性的研究

彭 濤 ，劉 琦，王千存，張懷予，路宏科，馬文錦，陳興葉，殷 欣

（1.甘肅省輕工研究院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070）

甘啤3號是甘肅省啤酒釀造專用大麥品種，在工業(yè)生產(chǎn)上表現(xiàn)出較好的制麥品質，但高海拔種植區(qū)的大麥仍存在發(fā)芽率較低、溶解性能較差等問題[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，制麥過程中添加一些有益微生物菌株（即生物制麥技術）可改善麥芽的溶解性，提高成品麥芽品質及安全性。

用于生物制麥的有益微生物主要有白地霉（Geotrichum candidum）、乳酸菌（Lactic acid bacteria）和根霉（Rhizopus）等。特別是白地霉培養(yǎng)物，是綠麥芽及焙燥麥芽中自然菌群組成菌種之一，毒理學研究表明其安全、無毒素遺傳性[2]。其生長過程中分泌的多種水解酶可促進大麥胚乳細胞的溶解，而且能有效地抑制麥芽中真菌毒素的產(chǎn)生，大大提高麥芽的安全性[3]。

本研究以甘啤3號大麥為原料，從中篩選出產(chǎn)β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纖維素酶和糖化酶活性較高的白地霉菌株，并對其生長特性進行研究，有利于今后進一步將篩選得到的白地霉應用到生物制麥過程中，以考察通過白地霉改善成品麥芽綜合品質的效果，為生物制麥工藝的優(yōu)化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株分離源

新鮮淺色甘啤3號大麥，其理化指標為水分15.3%、千粒重32.9g、蛋白質10.8%、發(fā)芽率65%，貯存于4℃冰箱中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；麥芽汁液體培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；5°P麥汁培養(yǎng)基；分解脂肪培養(yǎng)基（果羅德科瓦培養(yǎng)基）。

1.1.3 儀器

恒溫鼔風干燥箱；pH計；電子天平；7200型分光光度計；恒溫水浴鍋；PB203-N型分析天平；培養(yǎng)箱；顯微鏡；高壓滅菌鍋。

1.2 試驗方法

1.2.1 白地霉篩選分離

（1）采樣

無菌條件下選取100粒完整大麥于培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h，定期觀察培養(yǎng)過程并記錄，選擇生霉效果較好的大麥平板，備用。

（2）增殖培養(yǎng)

將上述菌種物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基，28℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。

（3）平板分離

將增殖培養(yǎng)后的菌種進行適當稀釋，涂布麥芽汁瓊脂平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察并記錄。

（4）初篩

挑取經(jīng)二次平板分離的菌株，進行麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，每株劃線3個平皿，保留生長能力較強的菌株。

（5）復篩

將初篩后的菌株再次接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，觀察其生長能力，保留生長能力較強的菌株。

1.2.2 酶活測定

取250mL三角瓶6個，每瓶裝50mL 4g/100mL麥芽粉懸浮液培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，冷卻至室溫。每個三角瓶接種菌株孢子懸浮液1mL，168r/min、28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，從第2d起，每天取一瓶發(fā)酵液，3000r/min離心10min。取上清液，適當稀釋后測定酶活[4]。

（1）β-葡聚糖酶[5]：在50℃、pH 5.0條件下，每分鐘水解β-葡聚糖產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量定義為一個酶活單位。

（2）木聚糖酶[6]：在50℃、pH 4.8條件下，每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1μmol木糖的酶量定義為一個酶活單位。

（3）纖維素酶[7]：在50℃、pH 6.0條件下，每分鐘分解羧甲基纖維素生成1μg葡萄糖的酶量定義為一個酶活單位。

（4）糖化酶[8]：在40℃、pH4.6條件下，每分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.3 菌種鑒定與保藏

（1）菌種鑒定：對篩選得到的2株生長能力較強、產(chǎn)酶活性指標較高的菌株進行鑒定：

細胞形態(tài)、菌落形態(tài)觀察、糖類同化試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、水解蛋白、分解楊梅苷測定及分解脂肪試驗：均參照《真菌鑒定手冊》從梗孢科地霉屬白地霉鑒定方法[9]。

（2）菌種保藏：將分離得到的菌株接種于麥芽汁斜面，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后于4℃冰箱中備用[10]。

1.2.4 菌株GQG28生長特性的研究

（1）最適生長溫度測定：將菌株GQG28種子接入麥芽汁液體培養(yǎng)基中，分別在10℃～37℃不同溫度恒溫振蕩培養(yǎng)（150r/min）10h，于波長660nm處測定培養(yǎng)液OD值，依據(jù)OD值大小確定其最適生長溫度。

（2）最低和最高生長溫度測定：將菌株GQG28種子接入麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于5℃～10℃的低溫和34℃～38℃的高溫150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8d，觀察有無菌體生長[11]。

（3）最適生長pH值測定：將菌株GQG28種子分別接入pH值3～9的不同麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于最適生長溫度條件下，150r/min振蕩培養(yǎng)10h，于波長660nm處測定培養(yǎng)液OD值，依據(jù)OD值大小確定其最適生長pH值。

（4）最低和最高生長pH值測定：將菌株GQG28種子液分別接入pH值為1～11的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于最適生長溫度條件下，150r/min振蕩培養(yǎng)8d，觀察有無菌生長[12]。

（5）生長曲線的測定：將菌株GQG28種子液以2%接入pH 5.4的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于最適生長溫度條件下，150r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2h用血球計數(shù)板計數(shù)法測定麥芽汁中的總菌數(shù)，并繪制生長曲線[13]。

2 結果與分析

2.1 菌種分離與鑒定

2.1.1 菌種篩選分離

（1）菌種篩選

培養(yǎng)期間觀察得到4個大麥樣品具有較強的生霉能力，結果見圖1。

圖1 菌種篩選結果Fig.1 The results of screening strains from barley

（2）平板分離

平板分離結果見圖2。

圖2 平板分離結果Fig.2 The result of the flat-panel separation

（3）增殖培養(yǎng)

平板分離后的菌株經(jīng)過增殖培養(yǎng)后出現(xiàn)菌落，見圖3。

（4）純種分離

經(jīng)過二次平板分離、初篩、復篩等步驟，共篩選出2株優(yōu)良菌株GQG28-1和GQG28-2，菌落形態(tài)見圖4。

圖3 菌株增殖培養(yǎng)結果Fig.3 The results of strains proliferation

圖4 純種分離結果Fig.4 The result of primary isolation

2.1.2 產(chǎn)酶情況

測定培養(yǎng)第2d～8d的發(fā)酵液相關的酶活，結果見圖5，最終篩選出GQG28-1、GQG28-2菌株水解酶活性見表1。

圖5 GQG28產(chǎn)4種酶活性變化曲線Fig.5 Change curves of activity of four kinds of enzyme produced by GQG28

表1 GQG28 菌株4 種酶活性Table 1 Four enzyme activities of produced by GQG28（U/mL）

由圖5可以看出，在培養(yǎng)第2d～7d時，β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酶活隨培養(yǎng)時間的延長而增大，在培養(yǎng)第5d時各酶活達到最大值，β-葡聚糖酶酶活為7.3U/mL，木聚糖酶酶活為9.5U/mL，纖維素酶酶活為8.8 U/mL，糖化酶酶活為16.0，之后酶活呈下降趨勢。

2.1.3 菌種鑒定及保藏

（1）細胞形態(tài)

對篩選得到的2株菌種GQG28-1和GQG28-2細胞形態(tài)觀察，見圖6。

圖6 GQG28-1（左，100×）和GQG28-2（右，100×）顯微照片F(xiàn)ig.6 The micrographs of GQG28-1 (left，100×)and GQG28-2(right，100×)

由圖6可觀察到，分離所得菌株的菌落形態(tài)，GQG28-1：菌絲寬4.5μm～5.5μm，裂殖，節(jié)孢子單個、成雙或成鏈，橢圓或圓形，分枝及曲彎少，圓頭；GQG28-2：細胞分布均勻，菌絲寬4.5μm～6.9μm，裂殖，橢圓或圓形，分枝及曲彎少，圓頭，有橫膈膜，節(jié)孢子單個或連接成鏈。

（2）菌落特征

篩選得到的2株菌種GQG28-1和GQG28-2菌落特征見圖7。

圖7 GQG28-1（左）和GQG28-2（右）的菌落形態(tài)Fig.7 The colony morphology of GQG28-1 (left) and GQG28-2 (right)

由圖7觀察可知，GQG28-1：菌落直徑為62mm，菌落呈白色、絨毛狀、扁平、均勻，放射線中心有突起；GQG28-2：菌落直徑為59mm，菌落呈白色、絨毛狀、扁平、均勻，放射線中心有突起。

（3）糖類同化

糖類同化測定結果見表2。

（4）醇類同化

醇類同化結果見表3。

（5）氮源同化

氮源同化結果見表4。

由表5可知，菌株GQG28-1、GQG28-2均不能分解楊梅苷、均能分解脂肪。

表2 糖類同化結果Table 2 The results of sugars assimilation

表3 同化醇類結果Table 3 The results of alcohols assimilation

表4 同化氮源結果Table 4 The results of nitrogen assimilation

表5 其它生理試驗結果匯總表Table 5 Summary of other physiological properties

根據(jù)《真菌鑒定手冊》綜合以上鑒定結果可以鑒定得出從甘啤3號大麥中篩選分離得到的2菌株是白地霉，分別為白地霉GQG28-1和白地霉GQG28-2。

2.1.4 生長特性的研究

（1）最適生長溫度

白地霉GQG28的生長溫度曲線見圖8。

圖8 溫度對白地霉GQG28生長的影響Fig.8 The effects on temperature on growth of Geotrichum candidum Link GQG28

由圖8可以看出，隨生長溫度的升高OD值增大，于25℃時達到最大值，故白地霉GQG28的最適生長溫度為25℃，在15℃～35℃溫度范圍內(nèi)生長良好。

（2）最低和最高生長溫度

分別于4℃～10℃的低溫和32℃～38℃的高溫下恒溫振蕩培養(yǎng)8d，考察菌體生長情況，試驗結果見表6。

表6 最低和最高生長溫度Table 6 The minimum and maximum temperature for growth

由表6可見，白地霉GQG28的最低生長溫度為5℃；最高生長溫度為37℃。

（3）最適生長pH值

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)做出白地霉GQG28的生長pH曲線圖，見圖9。

圖9 pH值對白地霉GQG28生長的影響Fig.9 The effect of pH value on growth of Geotrichum candidum Link GQG28

由圖9可以看出，白地霉GQG28生長適宜pH值范圍較寬，為4.4～6.8，其最適生長pH值為5.6。pH值低于4.4或高于6.8對其生長影響明顯。

（4）最低和最高生長pH值

將白地霉GQG28種子液分別接入pH從1～11的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)8d，觀察有無菌生長。該酵母菌在1.4～2.0的低pH值和9～10的高pH值麥芽汁中的生長情況見表7。

表7 最低和最高生長pH 值Table 7 The minimum and maximum pH value for growth

由表7可以看出，GQG28在麥芽汁中的最低生長pH值為3.2，最高生長pH值為11.0。故該菌種的生長pH值范圍較寬，并對酸性環(huán)境有較強的耐受性。

（5）生長曲線的繪制

將酵母菌Kloeckerasp.4-18種子液以2%接入pH 5.4的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于26℃、150r/min振蕩恒溫培養(yǎng)，每隔2h用血球計數(shù)板計數(shù)法測定麥芽汁中的總菌數(shù)。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)做出該菌種的生長曲線圖，見圖10。

圖10 白地霉GQG28的生長曲線Fig.10 The growth curve of Geotrichum candidum Link GQG28

由圖10可以看出，該菌株在前2h內(nèi)細胞數(shù)量增長不明顯，但細胞體積明顯增大，屬于接種遲滯期；當培養(yǎng)到2h～14h時，視野內(nèi)單個存在的細胞較多，細胞數(shù)以幾何級數(shù)增長，這一階段屬于對數(shù)生長期；培養(yǎng)到14h后菌量達到穩(wěn)定（約為7.8×108個/mL），并在14h～40h內(nèi)總菌數(shù)基本保持恒定，這一階段為恒定期。

2.1.5 白地霉制麥應用

將分離篩選出的白地霉GQG28菌株添加到制麥過程中，在最優(yōu)制麥條件下所制備的麥芽綜合指標為206.15，所制麥芽糖化力為308.5WK、α-氨基酸態(tài)氮為186mg/100g、浸出物相對質量分數(shù)為87.1%，均高于QB/T1686-2008[14]行業(yè)標準，與GB 2761-2011：食品安全國家標準[15]相比均未檢出真菌毒素，本研究利用白地霉制麥可以得到品質較高的大麥產(chǎn)品。

3 結論

3.1 從甘啤3號大麥中分離篩選出白地霉菌株，對白地霉所產(chǎn)生的4種主要水解酶進行動態(tài)測定及分析，篩選出2株產(chǎn)酶活性較高的白地霉菌株GQG28-1、GQG28-2。

3.2 對篩選得到的白地霉菌株的生長性能進行研究，得到白地霉GQG28-1、GQG28-2的最適生長溫度是25℃、最適生長范圍是5℃～37℃、最適生長pH值為5.6、最適生長pH值范圍是3.2～11。

3.3 利用篩選的白地霉制得麥芽綜合指標為206.15，所制麥芽糖化力為308.5WK、α-氨基酸態(tài)氮為186mg/100g、浸出物相對質量分數(shù)為87.1%，均高于QB/T1686-2008[14]行業(yè)標準，有效提高了麥芽的綜合品質。

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