豬皮明膠肽體內抗氧化功效的研究

張 閩，董文賓, *，張小強，蔡 理

（1.陜西科技大學 生命科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710021；3.空軍工程大學 理學院，陜西 西安 710051）

1902年，倫敦大學醫學院的Bayliss和Starling[1]第一次從狗的胃腸中分離到一種能引起胰腺分泌的活性多肽物質（促胰液素Secretin）以后，各國研究人員根據本國居民的膳食結構和蛋白質來源對活性肽進行了廣泛的研究。目前，活性肽以其優于氨基酸的吸收方式及無可比擬的生理調節功能，已成為天然藥物篩選和功能食品開發等領域研究的重點。因此，研究和開發肽類產品是20世紀以來生物技術領域中，人們極為關注且發展較為活躍的領域之一。

自由基氧化生物大分子變性引起機體結構和功能受損，從而誘導產生某些腫瘤、心腦血管疾病，引起疲勞、衰老，這些都已引起人們的強烈重視。抗氧化劑的消費量越來越大，生產量最大的化學抗氧化劑的毒副作用被逐步認識而受到限制，一些天然抗氧化劑也因為原料、價格、顏色等各種因素制約而發展有限[2]。因此低價、高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發成為研究熱點。選用利用率或生物學效價不高的廉價農副產品及食品工業廢水、廢物為原料（如大豆粕、玉米黃粉、大米渣、魚皮、魚骨等）制備寡肽已成為當今工業一個熱點[3-5]。各種原料生產的抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性強等特點受到重視，并能有效地清除體內過剩的活性氧自由基，保護細胞和線粒體的正常結構和功能，防止脂質過氧化的發生，在醫藥、化妝品、保健品、食品與飼料添加劑等方面有廣闊的應用前景。因而篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學、醫學和食品科學研究的新趨勢。我國是地大物博的國家，特別是在農產品資源方面，因此開發利用各種農產品生產高效的抗氧化劑具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級明膠（山東淄博杰樂寶恩生物科技有限公司饋贈），木瓜蛋白酶（Wolsen），KM封閉群無菌型小白鼠，雌雄各半（西安交通大學動物實驗中心），微量丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（德國Heraeus公司），MinimateTFFsystem型超濾機（英國PALL公司），PHS-3C型臺式pH計（上海精密科學儀器有限公司），JJ-1型精密增力電動攪拌器（上海浦東物理光學儀器廠），722N紫外可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），其他為常規儀器。

1.3 方法

1.3.1 明膠肽的制備

參考相關文獻[6-9]結合前期研究工作，用緩沖液在80℃溶脹明膠，木瓜蛋白酶水解明膠。酶解工藝條件：pH 6.2，酶含量4%，原料的質量濃度4%，水解溫度51℃，時間5h。水解中用攪拌器3000r/min攪拌輔助酶解，水解完成后100℃加熱25 min滅酶，水解液用高速冷凍離心機離心、過濾，澄清后超濾機篩選分子量低于5000u的上清液備用。

1.3.2 小白鼠分組飼養和運動訓練

按照體重進行隨機分組，共分成4個組，一個對照組和3個試驗組。且每組要多養2～3只預防灌胃或者運動訓練時溺水發生意外。日常自由采食飲水，灌胃飼養35d，灌胃時間安排在運動前2h，對照組灌胃雙重蒸餾水，試驗組給予水解明膠肽，飼養量為動物體重的3%。每天游泳訓練一次，每次20min，水溫（30±2）℃，不負重。

1.3.3 血清及組織勻漿的制備

血清的制備：運動后休息30min，用暖風機烘干小鼠，取血試管預先加入肝素抗凝劑（12500單位稀釋30倍），并低溫烘干。頸動脈無麻醉狀態下取血，搖勻，即刻再放回冰浴中冷卻，3000r/min離心10min，分離血清，然后將血清傾入另一潔凈試管低溫保存備用。

組織勻漿的制備：組織采樣在采血后進行，將小鼠放在粗糙的平面上，左手向下按壓頸椎，右手拉住小鼠尾部向后上方拉使頸椎脫臼處死小鼠（考慮化學麻醉導致組織留存較多血液，同時檢測指標受化學試劑干擾影響測試結果，避免化學麻醉處死），在冰面上解剖后剝離取前（后）肢、肺和肝臟，經冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，加5%三氯乙酸沉淀蛋白，取適量濕組織加生理鹽水按W:V=1:10在冰浴條件下用組織勻漿機制成勻漿（組織勻漿選小刀）。肺組織和肝臟控制轉速3000r/min，時間為10min；肌肉控制轉速為4000r/min，時間為15min，將上清液傾入另一潔凈試管低溫保存備用。

1.3.4 指標測定

按照試劑盒指定的方法測定微量丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力、總抗氧化能力（T-AOC）和過氧化氫酶（CAT）活力。

2 結果與分析

2.1 明膠肽對小鼠體重的影響

小鼠購買后隨機分組。對照組平均23.37g，方差0.91；實驗1#組平均24.15g，方差0.93；2#組平均24.2g，方差0.86；3#組平均24.1g，方差0.89。灌胃飼養35d后，對照組平均30.8g，方差1.37；實驗1#組平均31.2g，方差1.41；2#組平均31.5g，方差1.56；3#組平均31.3g，方差1.27。試驗組小鼠體重和對照組比較無明顯差異（p<0.05），說明明膠肽對小鼠體重無顯著影響。

2.2 明膠肽體內抗氧化功效的測定結果與分析

表1 明膠肽對小鼠血液抗氧化酶活性和MDA 生成量的影響(n=10)Table 1 Effects of gelatin peptide on antioxidant enzyme activity and MDA production of mice's blood (n=10)

表2 明膠肽對小鼠不同組織抗氧化酶活性和MDA 生成量的影響(n=10)Table 2 Effects of gelatin peptide on antioxidant enzyme activity and MDA production of mice's organs (n=10)

生物體內存在消除自由基的防御系統，即由一些酶和非酶物質組成的抗氧化劑。包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）。SOD使超氧自由基被氧化成O2及同時還原成為H2O2；CAT可使過氧化氫分解成為水和氧氣；GSH-PX可使還原型的谷胱甘肽轉變為氧化型的谷胱甘肽，從而消除細胞中的有機或無機的過氧化物。非酶抗氧化劑有維生素E、維生素C、胡蘿卜素、谷胱甘肽等，其可防止自由基的生成。這些抗氧化劑在體內構成一個完整的系統，分別對從氧化過程的開始到最后生成過氧化氫的自由基這一連鎖反應的不同環節起作用，使體內自由基形成和消除處于一種動態平衡中。

盡管機體內有著各種抗氧化劑和抗氧化酶，但隨著年齡的增長，體內抗氧化酶的活性逐步降低而氧自由基卻有增無減，從而導致生理系統功能衰退，并誘發多種癌癥及老年病。最近，國內外內許多研究表明，膠原水解所得到的膠原肽不但具有很好的消化特性，還有保護胃黏膜、抗潰瘍、抗氧化、抗過敏、抗衰老、降血壓、預防骨質疏松、促進傷口愈合、促進角膜上皮細胞的修復和生長、促進皮膚膠原代謝、免疫調節等許多獨特的生理活性，已引起研究人員的廣泛興趣，膠原肽的很多活性都與其抗氧化性有關。從表1、表2可以看出，血清、肌肉、肺和肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）活力與正常對照組比較均增大，總抗氧化能力（T-AOC）也顯示出一致的變化，體內各種抗氧化酶類在體內起到抑制自由基產生的作用。MDA是一種脂質過氧化產物，可直接反映機體的過氧化水平。實驗結果顯示，MDA生成量實驗組明顯比對照組低，以上數據均具有統計學差異性。表明明膠肽有著良好的體內活性，利用明膠肽灌胃小鼠具有提高生物抗氧化能力的功效，從而對機體起到保護作用。

依據已有的研究[10-12]，推測明膠肽發揮抗氧化活性與其氨基酸組成和肽分子構象有關。有許多抗氧化氨基酸在活性肽抗氧化過程中起到了重要作用，如亮氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸。脯氨酸或羥脯氨酸側鏈和α-碳能夠被自由基氧化，從而保護其他物質。而明膠肽中脯氨酸和羥脯氨酸含量在各種氨基酸含量中最高，推測明膠肽的這種氨基酸組成是其具有抗氧化作用的重要原因，此外，許多肽比構成其的氨基酸抗氧化性要強，所以保持一定的肽鏈構象同樣對活性肽的抗氧化活性有著很重要的作用。其作用機理還可能與其易吸收特性、高相融有關。

3 結論

大量的研究顯示[13-14]，生物體各器官均會產生不同程度的自由基，而同時也存在消除自由基的防御系統。正常情況下，自由基與自由基防御系統處于動態平衡中，一旦平衡被打破，自由基造成對機體的毒性作用。就會產生各種疾病，特別是一些慢性病如腫瘤、糖尿病、高血壓等，從而影響人體的健康。豬皮明膠酶解物可以有效地降低小鼠血清、肝組織、肺組織和肌肉組織中MDA的含量，提高小鼠血清、肝組織、肺和肌肉組織中的T-SOD、GSH-PX、CAT的活力和T-AOC。各項指標與對照組相比有極顯著差異，可以說明豬皮明膠肽具有一定的抗氧化性。

豬皮是豬肉生產過程中的一種副產品，在肉制品廠的豬肉加工過程中，豬皮經過熱處理后不能用于皮革制作，而在生肉的零售過程中，剔掉的碎豬皮亦無法用于皮革制作，除了部分食用外，其他的應用較少。豬皮的主要成分為蛋白質、脂肪、水，還有少量的纖維素和礦物質。豬皮蛋白質主要是膠原，膠原由于特殊復雜的空間結構，其分子量高達300ku，很難被機體消化吸收，通過蛋白酶水解可以將豬皮中的蛋白質水解為肽，其反應溫和，產品安全，適用于功能食品、化妝品及其他健康相關產品。本文主要以正常小鼠作對照，用自己制備的明膠肽喂養小鼠，各組自由飲水，自由攝食，飼喂35d后，禁食，頸動脈采血，并解剖取肝、肺和肌肉組織測定微量丙二醛（MDA）含量，總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）活性和總抗氧化能力（T-AOC）來研究明膠肽的體內抗氧化作用，以期為開發新的活性肽藥物和活性成分提供理論依據。

[1]李 勇.生物活性肽研究現況和進展[J].食品與發酵工業，2007，33（1）：3-9.

[2]李國英.膠原、明膠和水解膠原蛋白的性能差異[J].四川大學學報，2005，37（4）：54-58.

[3]裴小平，唐道邦，肖更生，等.抗氧化肽制備的應用現狀及趨勢[J].食品工業科技，2009，30（2）：319-322.

[4]楊彩艷，徐輝朝.寡肽研究進展[J].糧食與油脂，2009（5）：4-6.

[5]徐鑫鎂，施文忠.外源性抗氧化劑與人體健康之關系[J].上海體育學院學報，2000（24）：68-69，86.

[6]孟 歡，羅儒顯.木瓜蛋白酶水解明膠制備多肽的工藝研究[J].廣東化工，2010，37（1）：36-38.

[7]黃雅欽，夏冬敏，黃明智.用酶組合技術制備水解明膠的研究[J].明膠科學與技術，2000，20（4）：173-178.

[8]朱夕波，周培根，李 燕，等.豬皮膠原蛋白水解產物中的抗氧化活性肽的分離及其氨基酸組分[J].天然產物研究與開發，2009（21）：122-124.

[9]張 勤.酶法從鮮豬皮中提取生物活性肽[D].西北大學碩士學位論文，2005.

[10]MENDIS E,RAJAPAKSE N J,KIM S K.Autioxidant properties of a radical-scavenging peptide purified from enzymatically prepared fish skingelatin hydrolysate[J].J Agric Food Chem,2005,53(3):581-587.

[11]CHEN H M,MURAMOTO K,YAMACHIF.Structural analysis of antioxidantive peptides from soybeanβ-conglycinin[J].J Agric Food Chem,1995,43:574-578.

[12]NIEMELAO,PARKLAS,BRITTON RS,et al.Hepatic lipid peroxidation inhereditary hemoehromatosis and alcoholic liver injury[J].J Lab Clin Med,1999,13(5):133-141.

[13]耿 浩，劉云玲，馬 超，等.多棘海盤車體壁膠原蛋白肽的制備及其抗氧化活性[J].食品與發酵工業，2011，37（6）；42-46.

[14]牛付閣，王紀平，王 芳，等.覆盆子糖蛋白粗提物體內抗氧化作用研究[J].食品工業科技，2010（12）：134-136.