響應面法微波預處理稻草秸稈產還原性糖的優化研究

劉海臣，劉 猛，鄭其鑫

（1.中國礦業大學 化工學院,江蘇 徐州 221116;2.陜煤集團銅川礦業公司，陜西 銅川 727000）

人類面臨著能源危機和環境污染危機的雙重挑戰，如能將大量的農業廢棄物轉化成可發酵糖進而制備纖維素乙醇意義重大。由于秸稈結構復雜，纖維素被木質素和半纖維素緊緊包圍，具有高結晶度和難溶性等特點，這使其與催化劑或酶的接觸困難，不易水解。需要適當的預處理方法來解決秸稈纖維素不易水解的難題，當前文獻報道的多數預處理方法成本偏高，且有可能造成二次污染[1-8]。

以稻草秸稈為原料，從機械粉碎、微波處理等方面研究了預處理對稻草粉酶解的影響。由于微波加熱時間與微波功率之間交互影響較大[9-10]，故采用響應面分析法來確定微波預處理方法下的最優條件，為稻草粉預處理提供了一個新的研究方向。其中微波預處理是本研究的重點，該法與蒸汽爆破法及酸堿法相比具有節能環保，生產效率高的優點[11-15]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稻草秸稈：取自中國礦業大學文昌校區附近農家，經烘干粉碎篩分后測量主要成分為纖維素35.4%，半纖維素25.6%，木質素12.8%，灰分13.2%，其他組分13.0%，與其均值相差不大。

纖維素酶：活力單位15000U/g，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 還原糖濃度的測定方法

還原糖濃度的測定：從不同預處理方法處理過的稻草粉樣品中，分別稱取0.05g樣品，加入試管中，然后依次加入2.5mL酶活單位為30U/mL的纖維素酶溶液和2.5mL檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液。接著將其放入設置條件為50℃、150r/min的恒溫水浴搖床中，酶解1h。最后將酶解液用濾紙快速過濾，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定酶解液中的還原糖濃度。

1.2.2 試驗方法

將稻草粉烘干后，用粉碎機進行粉碎，然后用篩子分別篩出20目以下、20目（830μm）～32目（500μm）、32目（500μm）～60目（250μm）、60目（250μm）～120目（120μm）、120目以上5個粒徑級別。測5種不同粒徑大小下稻草粉對應的還原糖濃度（CRed），確定最佳的粉碎粒徑。

取32目（500μm）～60目（250μm）粒徑的稻草粉，對液固比、微波功率、微波加熱時間3個因素進行研究。采用的微波爐為格蘭仕WD800G，其輸出功率800W，有5種火力調節，分別為20%（160W）、40%（320W）、60%（480W）、80%（640W）、100%（800W）。

采用響應面分析法研究微波加熱時間與微波功率之間的交互影響，確定微波預處理方法下的最適條件。

2 結果與分析

2.1 機械粉碎預處理對稻草粉酶解效果的影響

分別稱取目數小于20目（830μm）、20目（830μm）～32目（500μm）、32目（500μm）～60目（250μm）、60目（250μm）～120目（120μm）、大于120目（120μm）的5種粒徑級別的稻草粉樣品0.05g樣品，根據上述實驗方法測定不同粒徑下的還原糖濃度，結果見圖1。

圖1 機械粉碎對稻草粉酶解的影響Fig.1 Effect of mechanical crushing on enzymatic hydrolysis of rice straw cellulose

由圖1可以看出，隨著稻草粉粒徑目數的增加，稻草粉酶解效果增加明顯，還原糖濃度增幅較大。機械粉碎主要是通過兩方面來提高纖維素的酶解效果：一是秸稈經粉碎處理后，木質素、半纖維素與纖維素的結合層被破壞，三者的聚合度降低，纖維素的結晶度減少，故反應性能和水解糖化率提高；二是隨著機械粉碎的力度加大，秸稈的粒徑減小、相對表面積增大，裸露在外的可供纖維素酶結合的位點增加，由米氏方程知，酶解速度與位點數成正比，故酶促反應速度增大。

雖然機械粉碎處理對秸稈效果明顯，但顆粒過小對后續的洗滌和過濾不利，故后續試驗采用的粉碎粒度為60目。單純依靠機械粉碎難以達到預期的糖化效果，需與其他的預處理方法聯合使用（如微波預處理方法）。

2.2 液固比對微波預處理效果的影響

將不同液固比的稻草粉經320W的微波處理的6min后，洗滌、過濾、烘干、酶解，測還原糖，結果見圖2。

由圖2可以看出，隨著液固比的增加，稻草粉酶解效果增加，還原糖濃度增大。當液固比達到30:1時，還原糖濃度達最大值。這說明液固比也是影響微波預處理效果的一個主要因素，若液固比太小，玻璃瓶中的液體迅速蒸干，稻草中的纖維素成分發生焦化，導致酶解還原糖量的下降；若液固比太大時，微波產生的熱量有很大一部分被水吸收，影響微波對稻草粉作用的效果。

2.3 微波功率對微波預處理效果的影響

在液固比為30:1，微波加熱時間為6min時，將微波功率分別設置為20%（160W）、40%（320W）、60%（480W）、80%（640W）、100%（800W）進行處理。結果見圖3。

圖2 經微波處理后不同液固比對還原糖濃度的影響Fig.2 Effect of ratios of liquid and solid on concentrations of reducing sugar after microwave pretreatment

由圖3可以看出，當微波功率為320W時，還原糖濃度最大，其實最適宜微波功率并不是一個固定值，與微波加熱時間存在著交互影響。即微波加熱時間越短，微波最佳功率越大；反之，微波加熱時間越長，微波最佳功率越小。微波功率較低作用時間較短時，微波對稻草粉纖維素的結晶度影響不大，而微波功率較高作用時間較長時，稻草中的纖維素成分發生焦化，導致酶解還原糖量的下降。

2.4 微波加熱時間對微波預處理效果的影響

在液固比為30:1，微波功率為40%（320W）時，將微波加熱時間分別設置為2min、4min、6min、8min、10min進行處理，結果見圖4。

圖4 不同微波加熱時間對還原糖濃度的影響Fig.4 Effect of microwave heating time on concentrations of reducing sugar

由圖4可以看出，當微波功率設定為320W時，微波最佳加熱時間為6min。較短或較長的作用時間都會導致酶解還原糖量的下降。

2.5 微波功率和加熱時間的協同作用對稻草粉酶解效果的影響

研究了微波功率和微波加熱時間對稻草粉酶解效果的影響，分別在20%（160W）、40%（320W）、60%（480W）、80%（640W）、100%（800W）5種火力下處理3min、6min和9min，酶解后測還原糖濃度（CRed）結果見圖5。

圖5 微波加熱時間與功率對還原糖濃度的影響Fig.5 Effect of microwave heating time and power on concentrations of reducing sugar

由圖5可以看出，微波功率和微波加熱時間是影響稻草預處理效果的2個重要的因素。每個加熱時間都有對應的最佳微波功率，此時有最高酶解CRed。其中，320W處理6min得到的CRed最高，為352.35μg/mL，與未經微波處理過60目的稻草粉（237.43μg/mL）相比，CRed提高了48.40%。另外，800W處理3min得到的CRed也很高。

2.6 微波預處理稻草秸稈優化條件的確定

根據Box—Behnken設計原則，選取液固比、微波功率、微波加熱時間3個對微波預處理影響較顯著的因素，以還原糖濃度（μg/mL）為響應值，得到的試驗數據見表1。

運用Design—Expert8.0.5軟件對表1數據進行二次多元回歸擬合得到回歸方程：Y=352.60-6.25A+5.55B-4.95C+0.29AB+0.090AC-30.69BC-33.12 A2-25.00B2-30.15C2（其中，Y為還原糖濃度，A為液固比，B為微波功率，C為微波加熱時間）。由分析結果（見表2）可知，模型的值為11.43，p<0.01，表現為顯著；失擬項為0.0534，表現為不顯著；復相關系數R=0.9763，說明該方程擬合度良好。

上述二次回歸方程的響應面及其等高線見圖6～圖8。從圖6～圖8可以看出：液固比（X:1）、微波加熱時間（min）、微波功率等3因素的二階模型及其交互作用對還原糖濃度的影響非常明顯，當某一因素固定時，隨著其他2個因素的增大，還原糖濃度的得率增加迅速，達到峰值后有所降低。對3因素二階模型及其交互作用影響還原糖濃度情況進行分析評價，得到最佳的工藝參數為液固比29.07:1、微波加熱時間5.23min、微波功率287.84W。

表1 基于Box-Behnken 設計的試驗結果Table 1 The results based on Box-Behnken design

表2 微波預處理稻草秸稈的響應面分析結果Table 2 The results of response surface analysis on rice straw by microwave pretreatment

求得的最優點為二階模型的最大值。該值是否最優，還需經試驗驗證。為使試驗更具操作性，故將液固比調整為29:1，微波加熱時間5min，微波功率320W，此時還原糖濃度為360.5μg/mL，與只經機械粉碎時的237.4μg/mL相比，其還原糖濃度提高了51.8%。

另外，借助F值還可以判斷各因素對微波預處理稻草秸稈的影響程度，F值越大，表明其影響程度越大。各因素對微波預處理水稻秸稈的影響次序為：微波功率和微波加熱時間的交互作用>液固比>微波加熱時間>微波功率。

圖6 微波加熱時間和液固比對還原糖濃度的影響Fig.6 Effect of microwave heating time and ratios of liquid and solid on concentrations of reducing sugar

圖7 微波功率和液固比對還原糖濃度的影響Fig.7 Effect of microwave power and ratios of liquid and solid on concentrations of reducing sugar

圖8 微波火力（功率）和微波加熱時間對還原糖濃度的影響Fig.8 Effect of microwave power and microwave heating time on concentrations of reducing sugar

3 結論

研究了稻草秸稈的預處理，首次通過響應面分析法對微波預處理稻草秸稈進行了條件優化，并對諸因素影響的顯著性進行了分析。

研究發現微波功率和微波加熱時間的交互影響較為明顯，采用了響應面分析法對其進行了的優化。微波預處理稻草秸稈的影響次序為：微波功率和微波加熱時間的交互作用>液固比>微波加熱時間>微波功率。得到的最佳優化條件為液固比29:1、微波加熱時間5min、微波功率320W，此時還原糖濃度為360.5μg/mL，為研究結果中最高，該結果與只經機械粉碎時的237.4μg/mL相比其還原糖濃度提高了51.8%。

[1]劉德禮，謝林生，馬玉錄.木質纖維素預處理技術研究進展[J].釀酒科技，2009（1）：105-110.

[2]孫 然，冷云偉，趙 蘭，等.秸稈原料預處理方法研究進展[J].江蘇農業科學，20l0（6）：453-455.

[3]鄧 輝，李 春，李 飛，等.棉花秸稈糖化堿預處理條件優化[J].農業工程學報，2009，25（1）：208-212.

[4]李輝勇，黃可龍，金 密，等.堿性預處理對稻草秸稈酶解的影響[J].湖南農業大學學報：自然科學版，2009，35（6）：611-614.

[5]幸 婷，程可可，張建安，等.利用木質纖維原料制取燃料乙醇預處理方法的研究進展[J].現代化工，2007，27（2）：92-95.

[6]王 敏，王 倩，吳榮榮.木質纖維素生產燃料乙醇預處理技術研究進展[J].衡水學院學報，2010，12（4）：106-109.

[7]徐 忠，汪群慧，姜兆華.氨預處理對大豆秸稈纖維素酶解產糖影響的研究[J].高校化學工程學報，2004，18（6）：773-776.

[8]田雙起，王振宇，左麗麗，等.木質纖維素預處理方法的最新研究進展[J].資源開發與市場，2010，26（10）：903-908.

[9]SAHA B C，BISWASA，COTTA M A.Microwave pretreatment，enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol[J].Biob Mat Bio，2008(2):210-217

[10]李榮斌，董緒燕，魏 芳，等.微波預處理超聲輔助酶解大豆秸稈條件優化[J].中國農學通報，2009，25（19）：314-318.

[11]SAHA C B，COTTA A M.Enzymatic saccharification and fermentation of alkaline peroxide pretreated rice hulls to ethanol[J].Enzyme Microb Technol，2007，41(4):528-532

[12]WANGK，JIANGJX，XUF，et al.Influenceof steaming explosion time on thephysic-chemical propertiesof cellulosefromLespedeza Stalks[J].Bioresource Technol，2009(100):5288-5290

[13]王許濤.生物纖維原料氣爆預處理技術與應用研究[D].鄭州：河南農業大學，2008.

[14]MOSIER N,WYMAN C,DALE B,et al.Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass[J].Bioresonrce Technol，2005(96)：673-686.

[15]田 龍，馬曉建.纖維素乙醇生產中的預處理技術[J].中國釀造，2010，29（5）：8-12.