紫紅曲霉液態發酵紅曲紅色素培養基的優化

李大鵬，孫文紅，高玉榮，王宇寧

（1.黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319;2.大慶家良食品有限公司，黑龍江 大慶 163515）

紅曲紅色素是紅曲霉在生長代謝過程中產生的天然紅色素，無毒、無副作用，屬于蒽醌衍生物，分子式為C22H24O5，溶于乙醇、水，被廣泛用于清酒、醬油、腐乳、豆醬、魚、肉、糕點等食品的著色，安全性高，熱穩定性強，對蛋白質的著色性好[1]，因此目前紅曲和紅曲紅色素的市場需求量正日益擴大。目前紅曲紅色素的生產方法有固態發酵和液態發酵2種方法。紅曲紅色素傳統發酵以固態發酵為主，由于液態發酵具有生產周期短，發酵條件容易控制，不容易污染等優點，近年來開始進行液態發酵生產紅曲紅色素的研究[2-4]。

紅曲紅色素是一種混合色素，主要包括紅色素和黃色素，隨著紅色素與黃色素比值（色調）的增大，色素顏色逐漸加深呈現紅色，因此，色調對紅曲紅色素的質量也有重要的影響。在前人對紅曲紅色素生產的研究中，只以紅色價為指標，而未考慮色調對紅曲紅色素質量的影響[2-6]。目前為止，還未見同時以紅色價和色調為指標對紅曲霉發酵生產紅曲紅色素進行系統研究的相關報道。因此本文以紅色價和色調為指標，對誘變得到的高產菌株紫紅曲霉M144液態發酵生產紅曲紅色素培養基進行了響應面優化，在提高紅曲紅色素產量的同時也加強了紅曲紅色素的視覺效果，使紅曲紅色素產品的質量進一步提高。

1 材料與方法

1.1 菌種

紫紅曲霉M144：以紅曲霉CICC5017為出發菌株，通過紫外誘變獲得的紅曲紅色素高產菌株，由黑龍江八一農墾大學食品學院微生物實驗室保藏[7]。

1.2 培養基

種子培養基：玉米粉5%，豆粕粉2%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 1.5%，pH 5.4，121℃滅菌20min。

基礎發酵培養基：玉米粉4%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 1.5%，pH 5.4，121℃滅菌20min。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將紫紅曲霉M144斜面菌種接入固體斜面培養基（PDA）中，30℃培養7d～10d。

1.3.2 紫紅曲霉M144種子液的制備

取1～2環紫紅曲霉M144斜面活化菌種接入液體種子培養基中，30℃、180r/min振蕩培養48h。

1.3.3 紫紅曲霉M144液態發酵

向裝有50mL基礎發酵培養基的250mL三角瓶中接種10%（5mL）的紫紅曲霉M144種子液，30℃、180r/min振蕩培養6d，測定發酵液的紅色價及色調。

第一種方法是基于對象的行為數據的協同過濾算法(Collaborative Filtering,CF)。通過在對象的歷史行為(例如用戶的瀏覽記錄，購買記錄等等)歸納出一種特定的模式，再通過這些行為記錄，利用一些基本的統計知識來分析這些用戶的歷史行為與產品的相似度。最后推薦將相似度最高且此用戶未瀏覽過的內容推薦給用戶。這種算法可依據收集的用戶的歷史數據，來推薦世界上的任何一種東西。這個算法的實施步驟主要來說可分為三個主要的階段：(1)收集、分析各個用戶的行為記錄。(2)尋找相近用戶。也就是找到和該用戶相似度最高的用戶。為了達到該目的，一般會使用調整余弦相似性來計算。

1.4 分析方法

紅曲紅色素色價的測定采用GS 15961-2005（食品添加劑紅曲紅色素國家標準[S]）[8]。

紅曲紅色素色調=OD505/OD420[9]。

1.5 實驗設計與數據分析方法

以紅色價和色調為指標，采用析因實驗設計[10]，篩選對紅色價和色調影響顯著的因子，實驗設計及結果見表1；然后進行最陡爬坡實驗，實驗設計及結果見表2；最后進行Box-Behnken中心組合實驗設計[10]，實驗設計及結果見表3；用SAS8.2進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 主要影響因素的確定

以液體深層發酵的基礎發酵培養基中各組份的含量為中心點，即玉米粉4.0%，豆粕粉2.0%，MgSO4·7H2O 1.5%，K2HPO4·3H2O 0.1%，對發酵培養基進行析因實驗，實驗設計及結果見表1。

表1 析因實驗設計及實驗結果Table 1 Experimental design and results of factorial experiment

經SAS軟件分析，玉米粉x1（p<0.01）、豆粕粉x2（p<0.01）的加量對紅色價影響顯著，MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O對紅色價的影響不顯著，因此把MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O固定在初始值即MgSO4·7H2O 1.5%，K2HPO4·3H2O 0.1%。玉米粉x1（p<0.01）、MgSO4·7H2O x3（p<0.01）的加量對色調影響顯著，豆粕粉和K2HPO4·3H2O對色調的影響不顯著，因此把豆粕粉和K2HPO4·3H2O固定在初始值即豆粕粉為2.0%，K2HPO4·3H2O為0.1%。

2.2 最陡爬坡實驗

析因實驗設計結果表明了Y1的主要影響因素為玉米粉和豆粕粉，Y2的主要影響因素為玉米粉和MgSO4·7H2O，根據此結果設計Y1和Y2的最陡爬坡路徑，實驗設計及結果見表2。

表2 Y1和Y2最陡爬坡實驗設計及結果Table 2 Design and results of Y1and Y2in steepest accent experiment

從表2可以看出，第4組實驗紅曲紅色素紅色價最高，說明Y1的最優點在第4組實驗附近。第2組實驗紅曲紅色素色價最高，說明Y2的最優點在第2組實驗附近。

2.3 響應面優化實驗

以最陡爬坡實驗的最佳點為中心點分別對紅曲紅色素的紅色價（Y1）和色調（Y2）進行Box-Behnken中心組合實驗和響應面優化，實驗設計及結果見表3。

對表3的分析結果進行多項式回歸擬合，得到回歸方程為：

圖1和圖2為計算得到響應面圖可看出對紅色價和色調響應的兩因素具有顯著的交互作用。

由SAS軟件進行脊嶺分析，可知模型Y1的最大極值點為X1=4.69，X2=2.32，紅色價Y1=290.94U/mL，其他成分不變即MgSO4·7H2O 1.5%，K2HPO4·3H2O 0.1%。模型Y2的最大極值點為X11=4.40，X3=1.68，色調Y2=1.17，其他成分不變即豆粕粉2.0%，K2HPO4·3H2O 0.1%。

表3 Y1和Y2Box-Behnken 中心組合實驗設計及結果Table 3 Design and results of Y1and Y2in Box-Behnken Central composite experiment

圖1 玉米粉和豆粕粉交互作用曲線圖Fig.1 Interaction diagram of corn power and bean power

圖2 玉米粉和MgSO4·7H2O交互作用曲線圖Fig.2 Interaction diagram of corn power and MgSO4·7H2O

把方程（1）和方程（2）聯合，經多元統計分析獲得最大預測紅色價與色調值為287.39U/mL和1.14，此時培養基組成為玉米粉4.52%，豆粕粉2.32%，MgSO4·7H2O 1.55%，K2HPO4·3H2O 0.1%。

2.4 響應面優化實驗的驗證實驗

以響應面優化獲得的最佳培養基和未優化的培養基進行對比實驗，實驗結果見表4。

表4 響應面法優化結果的驗證實驗Table 4 Confirmatory experiment of response surface optimization

由表4可知，在優化后的培養基中發酵后，平均紅色價為280.27 U/mL，比對照增加64.86%；平均色調為1.09，比對照色調值增加10.10%。

3 討論

目前對紅曲霉液態發酵生產紅曲紅色素的研究中，在對紅色素發酵條件研究方面大都采用單因子實驗或簡單的正交實驗，這種研究方法忽略了各因素間的交互作用對響應值的影響，而且在研究中只以紅色素的色價為指標，未考慮色價對紅色素質量的影響[2-4，11-12]。

本文同時以紅色價和色調為指標對紅曲霉液態發酵生產紅曲紅色素的培養基進行了實驗設計和響應面優化，利用析因實驗設計對紅曲霉發酵產紅曲紅色素培養基各成分進行了評價，成功地篩選出影響紫紅曲霉M144發酵產紅曲紅色素的關鍵培養基組分，省時省力，快速有效。在此基礎上通過中心組合實驗和響應面優化（RSM）建立了影響紅曲霉發酵產紅曲紅色素的二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優化了各因子水平，探討了各因子間的交互作用。

以誘變后的M144為出發菌株，在優化后的液體培養基中紅曲紅色素的紅色價和色調分別為280.27U/mL和1.09，紅色價比山東荷澤學院王廣峰[11]研究的結果提高80.81%，色調沒有對照，是目前以玉米為原料液態發酵生產紅曲紅色素的最高水平，與彭中健[12]以EW906為出發菌株，以大米為原料液態發酵生產紅曲紅色素的紅色價比高6.57%。同時大米的價格比玉米高40%，因此玉米是一種有優勢的生產紅曲紅色素的原料。通過對紅色素提取條件進行優化，有望進一步提高以玉米為原料生產紅曲紅色素的紅色價和色調。

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