改良Genome shuffling技術選育埃博霉素B高產菌株

龔國利，陳 松，李 慧，曾 橋

（1.陜西科技大學 生命科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 資源與環境學院，陜西 西安 710021）

埃坡霉素（epothilone，Epo）是最初從纖維堆囊菌Soce 90的發酵液中分離出來的細胞毒化合物，與紫杉醇的生物活性相似，也能穩定微管組裝過程而抑制細胞分裂，但兩者在化學結構和來源上完全不同。Epo不易受P-糖蛋白（P-glycoprotein）影響，因而抗腫瘤活性較強、抗腫瘤譜廣。且Epo水溶性較好，不良反應少，化學結構簡單，易修飾[1]。Epo共有8種衍生物，目前關于Epo A和Epo B的研究較多。纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）形態多變，次級代謝產物種類繁多，產量低且不穩定。

基因組重組（Genome shuffling）技術是近幾年新發展起來的一種微生物育種方法，該技術具有不需要事先知道微生物的遺傳背景，也可以對其進行遺傳育種的突出優點，使之成為了一種極其高效的微生物育種方法。Genome shuffling技術是指將具有不同正突變的不同菌株的全基因組進行隨機重組，快速選育出具有較大改進的雜交菌株的方法。ZHANGYX等[2]已成功地通過基因組改組的方法提高弗氏鏈霉菌的泰樂菌素的產量；RANJAN PATNAKIK R等[3]通過基因組改組技術使得乳桿菌的耐酸性能有了較大提高；DAINH等[4]通過三輪基因組重排將Sphingobiumchorophenoclicum對劇毒殺蟲劑五氯苯酚的耐受濃度提高了10倍以上，并可將培養基中所含的3mmol/L五氯苯酚完全降解。

本研究對Genome shuffling育種方法進行了改良，其主要特點是在遞歸原生質體融合的過程中增加了原生質體的誘變過程。并且用改良后Genome shuffling育種方法選育埃博霉素B高產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗所采用的出發菌株So072-21、So072-42、So072-35、So072-67系由原始菌株SoF5-08（埃博霉素B產量為13.8mg/L），經UV和DES復合誘變后獲得的高產埃博霉素B的突變株，其產量分別為17.5mg/L、18.5mg/L、18.4mg/L、17.9mg/L。

1.1.2 培養基

CNST培養基：KNO30.05%，Na2HPO40.025%，Mg-SO4·7H2O 0.1%，FeCl30.001%，微量元素液1mL/L，瓊脂2%，pH 7.2。

LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂2%，pH 7.4。

M26培養基：土豆淀粉0.8%，豆蛋白胨0.2%，葡萄糖0.2%，酵母粉0.2%，MgSO40.1%，CaCl20.1%，EDTA-Fe3+1mL/L，pH 7.2。

再生培養基（VY/2）：活性干酵母0.5%，VB120.5mg/L，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.1%，瓊脂2%，pH 7.2。

發酵培養基：糊精0.3%，蔗糖0.07%，葡萄糖0.02%，豆餅粉0.17%，MgSO4·7H2O 0.17%，無水氯化鈣0.3%，EDTAFe3+2mL/L，TE 0.5mL/L，pH 7.2，XAD-16 2%。

1.1.3 溶液

TPM液：0.01mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L K2HPO4-KH2PO4，0.008mol/L MgSO4，pH7.6，滅菌。MMM緩沖液：0.3mol/L甘露醇，0.02mol/L MgCl2·6H2O，0.02mol/L馬來酸，pH6.5滅菌。

Tris緩沖液：0.067mol/L，pH8.0滅菌。

EDTA溶液：80mL水中加入4g EDTA，磁力攪拌器攪拌，用NaOH調節pH值至8.0，定容至100mL，滅菌。

1.1.4 主要試劑

溶菌酶（lysozyme），購自Sigma公司，溶于MMM緩沖液中，濃度為2mg/mL。用G6細菌濾器過濾除菌后用。

1.2 方法

1.2.1 菌體的培養和收集

首先，將保藏的SoF5-08轉接到CNST斜面培養基上，30℃培養5d～7d，活化2～3次。再在液體M26培養基中活化一次，置于巡回式搖床（200r/min）上，30℃培養7d。培養至對數生長期。將培養好的菌液以4000r/min離心10min，收集菌體[5-6]。

1.2.2 原生質體的制備和再生

將出發菌株的細胞濃度都調整到1×108cell/mL，懸浮在30mL MMM中，再加入30mL濃度為2mg/mL溶菌酶液?；靹蚝笤?0℃水浴鍋中保溫30min。酶解后，2000r/min離心20min，收集原生質體，用MMM緩沖液洗滌一次。重懸于30mL MMM中待用。取0.5mL酶解好的原生質體懸液，用MMM緩沖液稀釋，加入到再生培養基VY/2上。30℃恒溫培養7d，直至長出單菌落[7-8]。

1.2.3 原生質體融合

取濃度為1×109cell/mL的出發菌株滅活的原生質體懸液各1mL混合，2000r/min離心20min，收集原生質體，去上清液后將原生質體懸浮于MMM緩沖液中，然后加入2mL 40%的PEG-MMM，30℃水浴保溫15min。離心洗滌，將融合后的原生質體重懸于MMM中，采用雙層培養法再生法，于30℃恒溫培養7d。根據融合子和滅活親本的再生情況計算融合率。

PEG的濃度分別為20%、30%、40%、50%，融合時間為10min；然后在取的的最佳濃度下，對融合時間進行實驗，設5min、10min、15min、20min 4個梯度。

1.2.4 改良后Genomeshuffling

首先進行原生質體的制備，將獲得的原生質體調整到1×107cell/mL，在80%致死率下進行UV誘變（30W、235.7nm、15cm、30s），然后收集誘變原生質體，進行融合再生，收集全部再生菌落即為F1代融合菌群[9]；再將F1代菌群作為出發菌株，經過誘變、融合、再生、所得的菌株為即為第二輪融合菌群F2代，如此反復進行3輪循環原生質體融合，再生。每將最終融合得到的菌群進行篩選和檢測，從而篩選到埃博霉素B高產菌株[10-11]。其流程：

Genomeshuffling對照組：A.取相同體積和濃度的出發菌株菌懸液，按照上述1.2.4方法進行操作。但在遞歸原生質體融合過程中不對原生質體進行UV誘變。B.取相同體積和濃度的出發菌株菌懸液，按照上述1.2.4方法進行操作。但過程中不加入溶菌酶，也不對原生質體進行UV誘變。

1.2.5 高產重組子的初篩

采用高通量篩選方法進行重組子的篩選，在無菌96孔板中的每一個孔加入200μL固體無菌GFM培養基，將誘變菌株平行接種在2塊96孔板上，命名為A板和B板。A板的每一個孔接種后加入一定量的吸附樹脂，30℃培養7d～10d。B板在30℃培養5d后，放在4℃保藏待用。A板培養結束后，加入200μL甲醇浸提埃博霉素，然后將浸提液轉到另一個新的96孔板中，用微板光譜儀閱讀波長250nm處的光吸收值，光吸收值較大的菌株就是目標菌株，再從B板上取出對應的目標菌株進行檢測。

1.2.6 高效液相色譜復篩

把1.2.6步驟獲得的目標菌株用液體M26培養基擴大培養，收獲的菌體用玻璃珠分散后接種到發酵培養基。接種量每50mL發酵培養基接種2×108個細胞。發酵體系：300mL三角瓶裝發酵培養基50mL，加1mL吸附樹脂。收集樹脂，干燥待用。

樹脂再用甲醇溶解浸提。采用HPLC對洗脫液進行定性分析和定量測定。色譜條件：Waters高效液相色譜系統；色譜柱，4.6×250mm；柱溫為室溫；流動相為甲醇:水（含0.5%乙酸）為65:35（v/v），紫外檢測儀，波長為250nm[8，12]，流速1.0mL/min，進樣量20μL。同時，以Sigma公司的埃博霉素B標準品對照。

1.2.7 重組子遺傳穩定性的測定

對獲得的埃博霉素高產菌株傳代培養5次，然后進行發酵篩選，選擇遺傳穩定性好，埃博霉素B產量高的重組菌株，予以保藏。

2 結果和分析

2.1 紫外線誘變時間的確定

紫外線致死曲線見圖1。由于現在紫外誘變育種一般都采用較低劑量，以獲得較高的正突變率。根據紫外線致死曲線，采用80%的致死率所對應的誘變劑量，即用功率為30W的紫外燈，照射距離為15cm的條件下，用紫外線照射30s。

圖1 UV存活曲線Fig.1 Survival rate of protoplast with UV-irradiation

2.2 原生質體的制備和再生

原生質體制備和再生是基因重排的關鍵步驟，研究中要確定培養基的種類、培養方法、滲透壓穩定劑、酶解時間和溫度以及酶解前的預處理等因素。在制備時，需要用EDTA預處理細胞液，提高細胞壁酶解效率。通過研究，選擇的滲透壓穩定劑是0.3mol/L甘露醇，EDTA預處理10min，酶解時間為30min。原生質體再生采用的是自然擴展法。

表1 原生質體制備條件對制備率的影響Table 1 Effect protoplast preparation conditions on the rate of preparation

2.3 原生質體融合

原生質體融合條件：PEG的類型、濃度、作用時間和作用溫度對融合率有很大的影響。本研究對這些因素做了系統的優化，見表2，發現作用效果最好的PEG類型是PEG 6000，濃度則為40%（w/v）；原生質體的融合率隨著PEG作用時間的增加而增加，但當達到一定的融合率后，繼續增加融合時間融合率將不再提高；另外融合時間過長將極大地降低融合子的再生率。融合過程中使用的溫度也對融合率產生一定的影響，30℃是一個合適的作用溫度[13]。

表2 原生質體融合條件對融合率的影響Table 2 Effect protoplast fusion conditions on the rate of fusion

2.4 改良Genome shuffling選育高產埃博霉素B菌株

出發菌群的獲得：基因組重排需要在一個具有不同正突變的特定的遺傳多樣性群體中實現隨機基因重組。為獲得具有正突變的出發菌群庫，本試驗采用UV+DES的3種劑量復合誘變的方法對原始菌株SoF5-09進行誘變，誘變完成后取原液涂布使之生長在分別含埃博霉素和前體的濃度中，30℃培養7d。挑選極限濃度下的生長的菌株，接入液體培養基中培養，用HPLC檢測誘變獲得的菌株產生埃博霉素B的能力。通過誘變共獲得了4株菌對埃博霉素B和前體有抗性，且埃博霉素B產量較原始菌株SoF5-09有所提高的菌株（結果見表3）。這4株菌（So072-21、So072-42、So072-35、So072-67）作為遞歸原生質體融合的出發菌株。

試驗中對基因重組技術進行了改良，即每輪融合中對原生質體進行了UV誘變。在遞歸原生質體融合過程中，每輪融合后取100個再生菌落測吸光度，再選取4株高吸光度值的菌株進行液體發酵，最后進行定量檢測。經過基因重排后，考察了1230株再生平板上的誘變融合菌落在96孔板上的生長情況，其中獲得了10株吸光度值（OD250）超過0.7的融合菌，剩余的1220株融合菌的平均吸光度值（OD250）為0.452，出發菌株的平均吸光度值（OD250）為0.315。每輪挑選4株高吸光度值的融合菌株進行搖瓶發酵考察，用HPLC進行定量檢測。最后獲得了2株高產埃博霉素B菌株So073-08和So073-45，產量分別為41.2mg/L、42.5mg/L（結果見圖2）。

表3 親本菌初篩過程中部分菌株實驗數據Table 3 Experiment date in the initial screen process of a part of strains

圖2 Genome shuffling 育種效果圖Fig.2 Effect of breeding by genome shuffling

對照組也同樣進行了3輪遞歸原生質體融合，A組中沒有對原生質體進行誘變，最終篩選的到菌株埃博霉素B產量最高可達到25.4mg/L。B組中既沒有對原生質體誘變，也沒有加入溶菌酶。最后篩選到菌株埃博霉素B產量與出發菌株相比無明顯變化。這證實了改良后的基因重組技術可以有效篩選出埃博霉素B高產菌株，比傳統的genome shuffling育種技術更高效。

2.5 重排菌株遺傳穩定性的測定

將篩選出來的2株高產埃博霉素菌株連續傳代5次后，進行搖瓶發酵培養，菌株的特征、顏色、生長速度都無明顯變化。用HPLC分析，菌株發酵合成埃博霉素B的產量沒有下降（見表4）。表明實驗篩選的重排菌株的高產性狀穩定。

表4 高產埃博霉素菌株不同代數菌株產量Table 4 Epothilone B production of high producing stains from different generation

3 討論

傳統誘變育種方法往往只能是一至幾個基因的作用（也可能是鄰近基因的突變效應），很難大幅度埃博霉素的產量；而Genomeshuffling則是幾個親本菌株在全基因組的不同位置上同時發生重組，容易發生多交換和多基因重組，促使不同基因重組到同一個細胞株中，相對容易實現大幅度提高菌株合成的產量。因此，Genomeshuffling技術能夠比傳統誘變選育更快速的改良菌株，加快人們模仿并加速微生物的進化方式的步伐[14]。

本研究對Genomeshuffling育種技術進行了改良，在遞歸原生質體融合過程中加入了原生質體誘變，最后成功選育出了2株產量較穩定的高產埃博霉素B菌株。

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