高鹽稀態醬油發酵S3-2酵母基礎發酵性能的研究

衛永華，于雁飛，王春玲，羅依青，侯麗華*

（1.天津科技大學教育部食品營養與安全重點實驗室，天津 300457；2.山東永康食品有限公司，山東 煙臺 264006）

釀造醬油是以大豆和小麥為原料，利用微生物分泌的各種酶將植物蛋白質及碳水化合物水解、發酵形成的具有獨特色、香、味、體的液體調味品[1]。S酵母又稱魯氏酵母，是最常見的耐高滲酵母，在醬油釀造過程中，S酵母能夠形成乙醇、高級醇、酯類、糠醛、琥珀酸和4-羥基-呋喃酮類等物質[2-3]，對醬油風味的形成起到重要的作用。但是在高鹽稀態醬油的實際生產中，醬醪的含鹽量通常高于18%，這極大的影響了S酵母的生存狀態和發酵活力，使其不能發揮應有的作用。因此S酵母的耐鹽能力是利用其改善醬油風味的一個“瓶頸”。

S3-2酵母是本實驗室以S酵母為出發菌株，利用基因組重組技術構建的一株具有高耐鹽度的新型酵母菌株[4]。以S酵母為對照菌株，對S3-2耐鹽能力和香氣成分產生能力進行比較研究，將可以為S3-2酵母在高鹽稀態醬油發酵中的應用提供一定的理論基礎，對促進S3-2酵母在實際生產中的應用也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

S酵母由天津科技大學菌種保藏中心提供；S3-2酵母是本試驗室以S酵母為出發菌株，經過基因組重組技術構建的新型耐鹽酵母。

1.2 試驗試劑

本實驗中所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

QP2010SE氣相色譜質譜聯用儀：日本島津有限公司。

1.4 培養基

YPD培養基[5]：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g溶于1000mL蒸餾水中，121℃滅菌15min。固體培養基需另添加15g～20g瓊脂粉。

YPDN培養基：在YPD培養基的基礎上，按試驗需要加入不同質量的NaCl，121℃滅菌15min。

YPD發酵培養基：稱取酵母粉10g、蛋白胨20g、NaCl 180g和葡萄糖60g溶于1000mL水中，115℃、15min滅菌。

1.5 試驗方法

1.5.1 S3-2酵母和S酵母的活化

從S3-2和S酵母的斜面培養基上各挑取一環酵母，接入YPD液體培養基中，于30℃、150r/min過夜活化培養。

1.5.2 S3-2酵母和S酵母耐鹽能力的比較

取適量活化好的酵母菌液轉接至含鹽量分別為18%、19%、20%和21%的50 mL YPDN液體培養基中，使菌液初始濃度達到5×106個/mL，并置于30℃、150r/min條件下振蕩培養。自接種（零時）算起，每隔12h在無菌室取樣，測定OD600，并繪制S3-2酵母和S酵母生長曲線。

1.5.3 S3-2酵母和S酵母基礎發酵性能比較研究

將活化好的S3-2酵母和S酵母依次轉接于含鹽量為12%和16%的YPDN液體培養基中，擴大培養至對數后期。將擴大培養的酵母轉接于裝有500mL YPD發酵培養基的厭氧瓶中，并置于30℃靜置發酵。每2d測定一次還原糖含量、乙醇含量和風味物質。全體樣品分為S酵母組和S3-2酵母組，每組樣品設3個平行樣品。

1.5.4 還原糖含量的測定[6-7]

采用菲林試劑容量法進行還原糖含量的測定。

1.5.5 乙醇含量[7-8]

采用蒸餾法法測定。

1.5.6 香氣成分的測定

樣品前處理[9]：本試驗利用頂空固相微萃取法（SPME）對發酵液中的香氣成分進行提取[10]。首先將聚二甲基硅氧烷（PDMS）固相微萃取頭在氣相色譜的進樣口老化至無雜峰，老化溫度250℃，時間50min。取5g發酵液樣品于15mL干凈的萃取瓶中，在45℃水浴平衡30min，再將老化結束的PDMS萃取頭插入瓶中。萃取頭與樣品液面應保持一定距離，避免萃取頭表面沾水。萃取溫度45℃，萃取時間30min。

色譜條件[11]：VF-5MS毛細管色譜柱（30mm×0.25mm×0.25mm），載氣：氦氣（純度99.999%），流量1mL/min，分流比5:1。PDMS萃取頭插入進樣孔，250℃解吸5min。

程序升溫：起始溫度40℃，保持30min，以4℃/min的速度升至150℃，保持1min，再以8℃/min的速度升至250℃，保持6min。

質譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度220℃，溶劑延遲時間1.5min，電子能量70eV，掃描質量范圍43u～500u。

數據分析：數據收集用HP化學工作站軟件對照NIST05庫進行，成分先由譜庫初步鑒定，結合化學成分的保留時間、質譜、實際成分、保留指數并參考相關文獻[12-13]進行定性。定量采用面積歸一化法相對定量。

2 結果與分析

2.1 S3-2酵母和S酵母耐鹽能力的確定

取活化好S3-2酵母和S酵母菌液轉接至含鹽量分別為18%、19%、20%和21%的YPDN液體培養基中，30℃、150r/min條件下振蕩培養，其生長狀況見圖1和圖2。

圖1 酵母S在高鹽YPDN培養基中的生長情況Fig.1 The growth of yeast S grown in YPDN medium with high concentration salt

由圖1和圖2可以看出，相同接種量的S3-2酵母和S酵母在不同鹽度條件下表現出不同的生長狀態。S3-2酵母在含鹽量達21%的培養基中仍能夠良好生長，但S酵母能生長的最大鹽度只有19%。且在19%的YPDN培養基中，S酵母進入對數期的時間比S3-2酵母推遲了將近24h；在18%鹽度培養基中，S酵母平穩期菌體濃度也低于S3-2在平穩期的菌體濃度。表明S3-2酵母比S酵母具有更高的耐鹽能力，其在高鹽環境中能更好地進行生存和代謝活動。

圖2 S3-2酵母在高鹽YPD培養基中的生長情況Fig.2 The growth of yeast S3-2 grown in YPD medium with high concentration salt

2.2 S3-2酵母和S酵母基礎發酵性能研究

酵母在醬醪的后期發酵中是一個以還原糖為碳源，進行厭氧代謝，產生醇類等風味物質的過程。YPD培養基含有豐富的碳源和氮源，與醬醪相比，其組分簡單，干擾少，有利于在短期內對S3-2酵母和S酵母的基礎發酵特性進行研究。同時，為了使YPD發酵培養基中的還原糖含量與醬醪接近，本研究將培養基中葡萄糖含量提高至6%。

2.2.1 S3-2酵母和S酵母的還原糖消耗能力和產乙醇能力比較

為了分別對S3-2酵母和S酵母的還原糖消耗能力和乙醇產生能力進行比較研究，本研究定時對接入2株酵母的YPD發酵培養基進行還原糖和乙醇含量測定，結果見圖3。

圖3 發酵培養基中葡萄糖和乙醇含量變化Fig.3 The changes of glucose and ethanol in the fermentation medium

圖3表明，在前2d內，由于S酵母菌體對高鹽環境需要一個適應過程，所以生長代謝不旺盛，還原糖的消耗和乙醇含量的增加都較為平緩。而S3-2酵母適應高鹽環境能力較強，在發酵第2d，乙醇的生成和還原糖的消耗反應已經以較快的速率進行。隨著發酵時間的延長，S和S3-2代謝速度加快，還原糖的消耗和乙醇的形成都有較快速的增加，但是S3-2酵母的還原糖消耗和乙醇產生速率要明顯高于S酵母。在發酵進行10d之后，由于還原糖被消耗殆盡和菌體的死亡，S3-2和S酵母產乙醇速率趨于平緩。綜上所述，在高鹽培養基中，S3-2酵母的還原糖消耗能力和乙醇產生能力要高于S酵母。乙醇具有清爽的香氣，是醬油的基礎物質。同時乙醇還可通過氧化和酯化反應生成有機酸和酯類物質，S3-2酵母較高的乙醇產生能力對促進醬油香氣形成是十分必要的。

2.2.2 S3-2酵母和S酵母產生香氣成分能力的比較

為了研究S3-2酵母和S酵母在高鹽環境中產生的香氣成分的特點，本研究對其在含鹽量為18%的YPD發酵培養基中的香氣成分進行GC-MS測定，結果見表1～表4。

從表1～表4可以知道，利用SPME-GC-MS方法檢測出來的風味物質包括酸類、醇類、酯類、酚類、醛類、醚類和酮類等化合物。本研究在S3-2酵母和S酵母發酵過程中檢出的風味物質分別有43種和41種，表明S3-2酵母在高鹽環境中可利用YPDN發酵培養基比S酵母產生較多的風味物質。酵母在不同的發酵時期產生風味物質種類和含量有著顯著地差異。

醇類是發酵體系中最重要的風味物質。隨著發酵的進行，其種類和含量一直處于上升狀態。在發酵結束時，與S酵母相比，S3-2酵母產生的醇類物質種類增加2種，含量提高4.89%。用PDMS固相微萃取纖維頭吸附的醇類多為高級醇，其中苯乙醇是醬油中關鍵的揮發性風味物質[14]，其除在添加S酵母的0d發酵培養基中未被檢出外，在其他樣品中一直以較高含量存在。苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，對醬油風味貢獻較大[15-16]。苯乙醇既能被氧化為苯乙醛和苯乙酸，又可與醇形成縮醛，還可與酸類物質形成苯乙酯類化合物，所以在后期相對含量減少。新戊醇有薄荷油味，在發酵的全部過程中都一直能檢測到；1-壬醇具有類似桔子和甜橙的氣息；十一醇具有玫瑰花香和柑橘、菠蘿的果香。這3種醇雖然相對含量不大，但在發酵過程中一直存在，可能也是S3-2酵母和S發酵產生的特征性風味。1，9-壬二醇僅在S酵母發酵到第6d時檢出，且不存在于S3-2酵母發酵體系中。3-呋喃甲醇具有刺激性，但隨著發酵的進行含量降低。

酯類物質的種類和相對含量隨著發酵的進行也呈現增加的趨勢。但表3、表4的結果表明，S3-2酵母產生的酯類物質種類和含量略低于S酵母。乙酸乙酯具有水果香氣，其是由酒精發酵階段的主產物——乙醇與乙酸酯化而成，隨發酵的進行含量升高。乙酸異戊酯具有較強的新鮮果香，稍甜，是蘋果、香蕉的主要香氣成分之一，主要由乙酸和異戊醇酯化生成。癸酸乙酯有葡萄酒香氣；丁酸苯乙酯呈蜂蜜的甜香味；十四酸乙酯呈椰子的香味；十六酸乙酯呈微弱奶油香氣。以上這幾種酯類化合物都可通過有機酸與乙醇的酯化反應生成。其在2株酵母的發酵體系中一直存在，但相對含量都不高，可能與發酵周期短，酯化反應進行不完全有關。

表1 S 酵母在發酵過程中產生的香氣成分的變化Table 1 The changes of aroma components of YPDN fermentation medium adding S yeast

表2 S3-2 酵母在發酵過程中產生的香氣成分的變化Table 2 The changes of aroma component of YPDN fermentation medium adding S3-2 yeast

表3 S 酵母在YPD 培養基中發酵產生的香氣成分的含量和種類變化Table 3 Changes of relative contents of different classes of aroma components in YPDN fermentation medium adding yeast S

表4 S3-2 酵母在YPD 培養基中發酵產生的香氣成分的含量和種類變化Table 4 Changes of relative contents of different classes of aroma components in YPD fermentation medium adding yeast S3-2

辛酸乙酯有類似白蘭地的香氣，并有甜味；棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香和奶油香氣；癸酸乙酯帶花生香氣的油狀液體。這3種乙酯類化合物也是一些酒類飲料的主要風味成分，僅在S3-2酵母發酵體系被檢出。

本部分檢出的有機酸主要有丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸和苯乙酸。其中，丁酸用作香味劑時，使用極微量時就能發出很強、很濃的氣味。其還參與酯化反應生成有愉快水果香味的丁酸乙酯和有雪梨香味丁酸異戊酯；苯乙酸廣泛存在于葡萄、草莓、可可、綠茶、蜂蜜等中。苯乙酸可能主要是由苯乙醇氧化而來。在低濃度時具有甜蜂蜜味，并且具有很強的殺菌作用。這4種物質在2個發酵體系中的含量相差不大。

本研究中被檢測的羰基類化合物種類和含量都比較少，主要的有乙二醇甲醚、異戊醚和2，4-二叔丁基苯酚，其在2個發酵體系中均被檢出。其中需要注意的是乙二醇甲醚和異戊醚具有一定的毒性，在發酵過程中應盡量避免其的生成。2，4-二叔丁基苯酚屬醫藥中間體和材料中間體，但在本試驗中大多呈跳躍性走低的趨勢。吡嗪類化合物主要有2-乙基-3-甲基吡嗪（具有加熱牛肉時發出的香味）和2，6-二甲基-吡嗪（呈刺鼻的炒花生香氣），其主要在發酵前期產生，隨著發酵的進行，含量越來越低。這充分說明在復雜的生物發酵過程中，許多物質會處于不斷的分解與合成中。

3 結論

綜上所述，S3-2酵母比S酵母具有更高的耐鹽能力。在含鹽量為18%的YPD發酵培養基中，具有更高的高級醇類物質產生能力。結合S3-2酵母較高的乙醇產生能力，可以初步判斷其為醇香型酵母。豐富的醇類物質不但能增加醬油的醇香，還可以為醬油后期的酯化反應提供充足的原料，因此，S3-2酵母的應用將對醬油風味的提高有著重要的意義。

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