產低溫脂肪酶菌株的篩選、純化及其部分酶學性質研究

王春雨，遲乃玉*，張慶芳

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

低溫脂肪酶具有高效、耐熱、作用周期短等優勢，在應用上具有中高溫脂肪酶無法取代的優越性，因此低溫脂肪酶廣泛的應用在食品、輕紡、皮革、香料、化妝品、洗滌劑、有機合成、醫藥等領域上。國外研究者對其中幾種典型的脂肪酶如來源于Candida rugosa[6]、Candida antarcticaA[7]、CandidaantarcticaB[8]、Rhizomucor miechei[9]、Thermomyces lanuginosus[10]的脂肪酶的應用進行了詳細的綜述，這些脂肪酶在油脂加工和食品工業、壽星藥物合成、生物能源、醫藥和化妝品等行業顯示出良好的前景。相比于國外，國內目前只有作為洗滌劑的堿性脂肪酶，而酯化或轉酯化用的脂肪酶還是空白。

本文從大連大黑山和渤海灣采樣，篩選產低溫脂肪酶的菌株，并對其產酶條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 土樣來源

渤海灣海水和大連大黑山土樣。

1.2 培養基

Luria-Bertani（LB）培養基[11]：胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，瓊脂1.5%，pH7.0。

初篩培養基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，CaCl20.02%，Tween80 1.0%，pH7.2。

發酵培養基：酵母膏0.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.2%，NaCl 0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，橄欖油2%（v/v），pH7.0。

在教學中，建立關系的前提是師生之間發生交流和交往，但現在的許多課堂，只是單向的教師講授、學生接收。教師的注意力主要在“教”，沒有注意到在“教”的過程中與學生發生交流和交往，建立某種超越客觀知識的情感關系。我試圖強調的是，在“教”的過程“之中”發生了什么。當前，我們沒有很好地區別什么是教師關注自己的教學本身，什么是關注教學“之中”發生的事情。這個區別不是特別明顯，但同時這個區別又是巨大的。

牛肉膏蛋白凍培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，Na-Cl 0.5%，瓊脂1.8%，pH7.0。

1.3 產低溫脂肪酶菌株的初篩

樣品稀釋至10-7后，接種于初篩培養基平板上，20℃培養4d。產脂肪酶的菌株能分解Tween80在菌落周圍形成白色沉淀圈。將產生白色沉淀圈的菌株活化后，分別接種于初篩培養基平板上，記錄菌落直徑與沉淀圈直徑之比。

1.4 產低溫脂肪酶菌株的復篩

將待測菌株活化后，接種于種子液中，20℃、160r/min培養12h，轉接于100mL發酵液中，20℃、160r/min培養2d，測其酶活。

1.5 產低溫脂肪酶菌株的紫外誘變

選出一株菌落直徑與沉淀圈直徑之比和酶活最大的菌株，將其制成種子液，在20℃、160r/min培養12h。把菌液稀釋到適當梯度，置于磁力攪拌器上，在紫外燈的功率15W，照射的距離為30cm的條件下，照射不同時間進行紫外誘變。分別吸取不同照射時間的稀釋液均勻涂布到初篩培養基上，裝入黑布袋中，倒置于恒溫箱中，在20℃培養3d，取出計算菌落數，并觀察白色沉淀圈。

1.6 脂肪酶活性測定方法

取3mL 50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）和1mL橄欖油，放入水浴恒溫磁力攪拌37℃中預熱5min，加入0.1mL酶溶液，磁力攪拌10min，立即加入8mL笨，繼續攪拌2min，終止反應，同時萃取生成的脂肪酸。將溶液轉移至離心管中，4000r/min離心10min，有機相和水相分離澄清。取上層有機相4mL于小錐形瓶中，加入1mL顯色劑，磁力攪拌上攪拌3min，4000r/min離心10min，取上層含有脂肪酸銅的苯溶液，用分光光度計在波長710nm處測OD值。

由脂肪酶活力定義得活力計算公式：脂肪酶活力（單位/mL）=CV/TV’，公式中C脂肪酶的濃度（μmol/mL）；V脂肪酸/苯溶液的體積（mL）；T作用時間（min）；V’酶液的用量（mL）。

1.7 產脂肪酶菌株的鑒定

1.7.1 形態學、生理生化特征

產脂肪酶菌株的形態學觀察、生理生化實驗參照文獻[12]方法進行。

1.7.2 16SrDNA序列測定和分析

以菌株CZWOO1總DNA為模板，利用真細菌的16SrDNA通用引物進行PCR，產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一條1.5bp左右的條帶（見圖1）。以Seq Forward、Seq Internal和16SSeqF1為引物進行DNA測序。序列分析結果表明，菌株CZWOO1的16SrDNA序列得到有效擴增，其大小為1429bp。進入NCBI主頁，應用BLAST程序與數據庫中的已有細菌16S rDNA序列進行相似性比較分析。利用ClustalX1.83進行匹配比對，然后用MEGA5.05軟件構建系統發育樹。

圖1 3%瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 3% Agarose gel electrophoresis

2 結果

2.1 菌種篩選

從59株來自大連大黑山土樣和渤海灣海水的細菌中篩選到10株產低溫脂肪酶的菌株，其中以菌株007的直徑比最大且酶活最高，其酶作用溫度最低（25℃）。對該菌株進行紫外誘變，當誘變130s時，致死率達到90.7%，得到一株直徑比和酶活明顯高于原菌株的菌株，命名為CZWOO1。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態學、生理生化特征

菌株CZWOO1在LB培養上20℃培養3d，菌落乳白色、圓形、隆起、不透明、表面光滑、濕潤、邊緣整齊，直徑約0.9cm。菌體革蘭氏陰性、短桿狀。常規生理生化特征見表1。

2.2.2 分子生物學鑒定

序列分析結果表明，菌株CZWOO1的16SrDNA序列全長為1429bp。將序列輸入GenBank進行BLAST相似度比較，下載相似度序列，利用ClustalX進行多序列匹配比對，通過MEGA5.05軟件計算出序列的系統進化距離，采用Neighbor-Joining構建系統進化樹（見圖2）。菌株CZWOO1與Bacillusthuringiensis（NR 043403.1）親緣關系最近，同源性達到100%，因此菌株CZWOO1屬于芽孢桿菌屬中的蘇云金芽孢桿菌，命名為BacillusthuringiensisCZWOO1。

2.3 脂肪酶的分離純化及二級結構預測

表1 菌株CZWOO1 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain CZWOO1

圖2 菌株CZWOO1基因系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic trees for 16S rDNA sequence of CZWOO1

蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶發酵上清經65%硫酸銨沉淀，用0.05mol/LTis-Hcl緩沖液（pH8.2）溶解，并用相同的緩沖液4℃透析12h獲得粗酶液。經截留分子量為10ku的中空纖維柱超濾濃縮，將濃縮液加到預先用Tis-Hcl緩沖液（0.05mol/L pH8.2）平衡好的DEAE-纖維素-52層析柱（Φ1.6×30cm）上，用250mL 0～1mol/L的NaCl線性梯度洗脫。利用平板定性檢測脂肪酶活性，收集含脂肪酶各管，測定其酶活，合并含酶活各管。將樣品過Sephadex G-100（Φ1.6×50cm）柱，用0.05mol/L Tis-Hcl緩沖液（pH8.2）洗脫，收集有酶活性部分，結果見圖3。蛋白曲線呈現一個小峰和一個大峰，而低溫脂肪酶酶組分主要集中在大峰內，25管～45管范圍內的蛋白峰酶活性比較高，說明Sephadex G-100凝膠柱已經除去了一部分高分子量和低分子量的蛋白，將目的酶蛋白同其他雜蛋白分離開來。

蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶發酵上清液經硫酸銨沉淀、超濾離心、DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析等純化步驟，脂肪酶純化倍數為75.5倍，活性回收率為37.6%。其中DEAE-纖維素-52離子交換層析效果最佳，僅此一步就純化了56倍（純化效果見表2）。SDS-PAGE凝膠電泳[9]顯示純化后的脂肪酶為單一條帶（見圖4），分子量約為40ku。純化倍數為75.5倍，活性回收率為37.6%，跑12%SDS-PAGE電泳為單一條帶（見圖4），分子量約為40ku。

對多次分離純化的低溫脂肪酶進行圓二色譜分析，見圖5。用Jascow32軟件分析及Yang-chen公式計算其二級結構成分：α-螺旋10.6%，β-折疊40.1%，β-轉角18.8%，無規則卷曲30.5%。

圖3 Sephadex G-100 凝膠過濾Fig.3 Gel filtration chromatogram of Sephadex G-100

表2 脂肪酶的純化Table 2 Purification of Bacillus thuringiensis CZWOO1 lipase

圖4 12%SDS-PAGE電泳圖Fig.4 12% SDS-PAGE of enzyme solution

圖5 低溫脂肪酶圓二色譜圖Fig.5 The CD spectrum of cold-active amylase

2.4 脂肪酶性質

2.4.1 pH值對CZWOO1脂肪酶活力的影響

在30℃、不同pH值條件測定菌株CZWOO1脂肪酶活力，結果見圖6。該酶的適宜作用pH值范圍在7～9，最適pH值為8。

圖6 p H值對CZWOO1脂肪酶活力的影響Fig.6 Effects of pH value on lipase activity of CZWOO1

2.4.2 溫度對CZWOO1脂肪酶活力的影響

圖7 溫度對CZWOO1脂肪酶活力的影響Fig.7 Effects of temperature on lipase activity of CZWOO1

在pH8.0條件下，測定10℃～45℃溫度范圍酶活力與溫度的關系，結果見圖7。CZWOO1脂肪酶活力在25℃達到最高，在10℃是仍具有較高的酶活，相對酶活達到38%。

2.4.3 溫度對CZWOO1脂肪酶穩定性的影響

將酶液在不同溫度中保溫30min，在25℃、pH8.0條件下，測定CZWOO1脂肪酶殘余活力。結果見圖8，CZWOO1脂肪酶穩定性較差，在60℃處理30min，酶活損失達70%。

圖8 溫度對CZWOO1脂肪酶穩定性的影響Fig.8 Effects of temperature on lipase stability of CZWOO1

3 討論

菌株CZWOO1為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，不能水解淀粉、明膠、纖維素和尿素，能水解油脂，使阿拉伯糖、木糖和甘露糖產酸，吲哚和檸檬酸鹽試驗陰性。從菌株CZWOO1基因系統發育進化樹看，菌株CZWOO1與Bacillus thuringiensis（NR 043403.1）親緣關系最近，同源性達到100%，因此菌株CZWOO1屬于芽孢桿菌屬中的蘇云金芽孢桿菌，命名為BacillusthuringiensisCZWOO1。

蘇云金芽孢桿菌CZW001脂肪酶發酵上清液經硫酸銨沉淀、透析、超濾離心、DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析得到電泳純的脂肪酶，跑12%SDS-PAGE電泳為單一條帶，分子量約為40ku。對純化后的低溫脂肪酶進行圓二色譜分析，結果表明，其二級結構成分：α-螺旋10.6%，β-折疊40.1%，β-轉角18.8%，無規則卷曲30.5%。對該脂肪酶二級結構的預測給其適冷機制的研究奠定基礎。

對BacillusthuringiensisCZW001分泌的脂肪酶的初步研究表明，該脂肪酶的適宜作用pH值范圍在7～9，最適pH值為8，最適作用溫度為25℃，對熱敏感，60℃處理30min僅殘留30%酶活性。該低溫脂肪酶在低溫下具有良好的催化活性，作用pH值偏堿性（pH7～9）等特點，應在環境治理、洗滌業等領域有著良好的應用前景，并且其對熱敏感等特點，從而避免高溫滅活對食品品質產生的破壞，在食品工業也有良好的應用潛力。

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